大环内酯类耐药肺炎支原体研究进展

王冰洁， 张 泓

（上海交通大学附属儿童医院 上海市儿童医院检验科，上海 200040）

肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，MP）是上、下呼吸道感染，包括社区获得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）最常见的病原体之一，常引起非典型肺炎，尤其是儿童社区获得性非典型肺炎，也会同时或依次引起神经系统、消化系统等肺外症状[1-4]。各年龄人群均易感MP，但多发于儿童和青少年，易引起暴发流行。MP缺乏细胞壁，对作用于细胞壁的β-内酰胺类抗菌药物天然耐药。此外，不推荐儿童使用喹诺酮类和四环素类抗菌药物。因此，大环内酯类抗菌药物是治疗儿童MP感染的首选药物[5]。随着此类药物的广泛应用，大环内酯类耐药肺炎支原体（macrolide-resistantMycoplasma pneumoniae，MRMP）肺炎在世界范围内蔓延，严重限制了儿童患者的治疗选择。本文就MP对大环内酯类抗菌药物的耐药情况、耐药机制及流行基因型和实验室检测等进行综述，以了解MRMP感染的流行病学特征，为疾病的早期诊断和及时治疗提供参考。

1 MP大环内酯类抗菌药物耐药现状

自2001年日本首次报道从临床样本中分离出MRMP后，亚洲、欧洲和北美洲相继出现相关报道。MRMP在不同地区的流行差异较大，在中国、日本和韩国等亚洲国家普遍高度流行，在北美洲、欧洲、非洲地区相对低度流行。国内外MP对大环内酯类的耐药形势较为严峻，美国MRMP占3%～10%[6]，欧洲除意大利（26%）外，其他地区均低于10%[7]，法国大环内酯类耐药株检出率为8.3%[8]，德国2016—2018年大环内酯类耐药率约3%[9]，南非2012—2015年的MP均为敏感株[10]，日本2008—2015年儿童MRMP的检出率为50%～90%[11]，我国除南京外（20%），北京、上海、新疆、云南和哈尔滨等地儿童MRMP的检出率仍然较高（66.7%～86.7%）[12]。QU等[13]发现北京2010—2012年儿童MRMP检出率为94.3%，略高于成人（83.8%），但这种差异与特定的多位点可变数目串联重复序列分析（multiple-locus variantnumber tandem-repeat assay，MLVA）型别无相关性。韩国2015年MRMP检出率为87.2%，较2011年的62.9%明显上升[14]。

有研究结果显示，日本2008—2012年MRMP检出率高达81.6%，2013年逐渐降低至43.6%，可能与2011年日本MP治疗指南允许对部分MRMP感染患儿使用氟喹诺酮类药物有关[11]。我国也有研究报道部分地区MRMP检出率下降，但具体原因仍需进一步分析[12]。相关研究结果[15-16]提示，合理使用抗菌药物可能是控制MRMP的关键。

2 MP对大环内酯类抗菌药物的耐药机制

大环内酯类抗菌药物可结合核糖体50S亚基23SrRNA结构域V区或Ⅱ区的特定核酸，通过使肽酰基tRNA与核糖体提前分离而抑制蛋白质合成，达到抑菌作用。MP耐药株的体外药物敏感性试验结果显示，23SrRNA点突变与大环内酯类抗菌药物耐药高度相关，常见的突变位点是2063、2064和2617[17]。A2063G点突变、A2064G与14元、15元大环内酯类高水平耐药有关，而2617点突变导致的耐药性水平相对较低[17-19]。值得注意的是，我国MRMP最常见的是23Sr RNA 结构域V区A2063G突变。北京2010—2012年MP耐药监测数据表明，分离自成人和儿童的MRMP几乎都携带A2063G突变，2014—2016年分离的53株MRMP中，除1株携带A2064G突变外，其他菌株均携带A2063G突变[13，17]，与其他文献[20-21]结果一致。同样，日本和美国大环内酯类耐药MP也以A2063G位点突变为主[11，22]。此外，PEREYRE等[23]发现核糖体蛋白L4、L22保守区的缺失或插入也可能导致MP对大环内酯类耐药，他们用克林霉素和泰利霉素在体外诱导核糖体蛋白L4发生单核苷酸H70R或H70L突变，泰利霉素诱导核糖体蛋白L22出现P112R和A114T替换和111IPRA114缺失。但其他相关研究结果表明，MP临床分离株中核糖体蛋白L4、L22突变在所有耐药和敏感菌株中均可出现，与耐药性无关[15，24]。另外，MP也可能通过主动外排系统或核糖体甲基化修饰等其他机制对大环内酯类抗菌药物产生抗性[25]。

由于MP的23SrRNA只有1个拷贝，所以单个突变就可以改变大环内酯类耐药表型，而大环内酯类抗菌药物的过度使用会增加23SrRNA基因突变的可能性。有研究结果显示，感染大环内酯类敏感的肺炎支原体（macrolide-sensitive M. pneumoniae，MSMP）的患者在使用阿奇霉素24 d后可发生耐药突变[15]，大规模使用大环内酯类抗菌药物后耐药性克隆的出现频率显著增加[16]，提示耐药菌株的出现与流行可能与大环内酯类抗菌药物的过度使用有关，合理使用抗菌药物十分重要。

3 MP的分子流行病学特征

目前常用的MRMP的感染流行病学监测方法有P1基因限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分型和MLVA分型。随着全基因组测序技术的发展，多位点序列分析（multilocus sequence typing，MLST）和单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）等分辨力更高的分型方法将被用于临床常规检测和暴发流行调查[2]。

P1基因RFLP分型方法已被使用了约20年，该法将MP分为P1-Ⅰ型和P-Ⅱ型2种型别。SUN等[26]发现，北京2003—2015年分离的480株MP中，P1-Ⅰ型为主要型别（82.6%～95.4%）。美国、法国也以P1-Ⅰ型为主[8，22]。 俄罗斯、哥伦比亚等国流行P1-Ⅱ型或其变体[27]。除P1基因分型外，MLVA也是一种常用的分子分型方法。MLVA 4-5-7-2和3-5-6-2是主要类型。分别占50.6%～55.1%和14%～20.8%[28-29]。P1基因RFLP分型与MLVA分型有一定关联，如MLVA-4-5-7-2与P1-Ⅰ型相关，而MLVA3-5-6-2通常属于P1-Ⅱ型或其变异体[30]。也有研究发现P1基因RFLR分型或MLVA型与大环内脂类耐药无明显联系，其存在多克隆传播，耐药基因的不断出现与治疗过程中不断出现的突变有关，而不是人与人之间的单克隆传播[2，30]。然而，在多数耐药率相对较高的研究中，大环内酯类耐药的MP中检出的MLVA4-5-7-2显著多于其他型别，而在非耐药的菌株中MLVA3-5-6-2为主要优势型别[12-13，30-31]。我国香港的一项研究发现，2011—2014年MP对大环内酯类抗菌药物的耐药率增长了3倍，MLVA单一型别的克隆传播导致耐药率的增长，MLVA 4-5-7-2型从25%增长到100%[29]，与其他相关报道[12-13，32]一致。另外，日本对2011—2017年MP的流行病学分析结果表明，2015年后MRMP的检出率降低与P1-Ⅱ型谱系菌株的增加有关[33]。但目前尚无证据直接证明耐药与P1基因亚型或MLVA亚型有明显关联。2014年，有学者利用MP基因组中8个管家基因（ppa、pgm、gyrB、gmk、glyA、atpA、arcC、andadk）把57株MP分为12个ST型别、2个主要克隆群，其分辨率比P1基因RFLP分型和MLVA分型更高[34]。韩国学者用MLST把2000—2016年146株MP临床分离株分为8个ST型别，其中常见的是ST3型和ST14型，分别占74.7%和15.1%，其中98.3%的MRMP为ST3型[35]。日本2002—2016年MP中最常见的型别是ST3，而MRMP主要为ST3（74.6%）和ST19（11.4%）[36]。这些研究结果均表明ST3型的克隆传播可能与MRMP的增加有关。

4 实验室检测方法

控制MRMP感染的重要措施是早期快速检出MP及耐药MP，从而指导临床治疗。MP分离培养和体外药物敏感性试验是诊断MRMP感染和治疗的金标准，但由于生长条件要求苛刻，且培养周期长，结果受多种因素影响，不适合常规检查。建立新的快速检测方法，如目前临床常用的聚合酶链反应扩增法，具有快速、灵敏的优点，有助于及时控制MRMP的暴发流行[37]。

4.1 常规方法

MP培养法是世界卫生组织推荐的诊断金标准，可分为固体培养法和快速液体培养法。MP固体培养法需要2～4周时间，灵敏度也较低，尽管随着培养基的改进，其敏感性得到一定程度的提高，但特异性仍较低，易受其他微生物的污染而出现假阳性。血清学检测方法由于快速、经济的优点而在临床中被广泛应用，但通常需要收集急性期和恢复期双份血清，抗体滴度呈4倍或4倍以上增高或减低时才有意义，且耗时2～3周，结果受抗体产生、患者年龄、免疫功能的影响，如某些轻度感染者或婴幼儿及免疫缺陷者不能产生抗体，会导致漏诊，也不宜作为早期快速诊断方法[38-39]。

4.2 分子生物学检测技术

近年来，临床常用核酸扩增技术检测MP的DNA或RNA，常用的实验方法有传统聚合酶链反应、实时定量聚合酶链反应和环介导等温扩增技术等，常用的扩增靶基因有P1黏附蛋白基因、16S rRNA、ATP酶基因和各种转录翻译因子等。这类技术具有特异性高，检测速度快等优点，具有广泛的应用前景[40]。

胡文娟等[41]建立了新型MP实时荧光定量聚合酶链反应检测方法，并与传统的巢式聚合酶链反应、分离培养法等进行对比，总符合率分别达88.1%、83.5%，且检测灵敏度可达10拷贝，更快速、经济，具有很高的科研和临床应用价值。环介导等温扩增技术是一种较新的直接检测临床标本中多种微生物的等温扩增技术，其利用寡核苷酸引物和链置换聚合酶在恒温下扩增目的片段，结果肉眼可见。该方法目前已被成功运用于检测MP。YUAN等[42]使用环介导等温扩增技术在北京307医院2016—2017年收集的125份标本中检出43例MP，而实时定量聚合酶链反应检出40例。提示环介导等温扩增技术具有很高的特异性和灵敏度，尤其适合MP的快速检测，在儿童患者中有很好的应用前景。

目前，学者们对MP是否为上呼吸道正常菌群存在争议。有研究结果表明，健康人上呼吸道MP携带率很高，且死亡MP的DNA可持续7个月之久，血清学方法和实时定量聚合酶链反应不能区分无症状携带和感染[43-44]。而RNA只存在于增殖存活的病原体内，故以RNA为基础的检测MP RNA放大技术能够区分MP的感染和携带。实时荧光核酸恒温扩增检测（simultaneous amplification and testing，SAT）技术是我国自主研发的专利技术，通过磁珠法提取特异性核酸，具有很高的特异性，目前在结核分枝杆菌检测中应用广泛，但在MP检测中应用较少。LI等[45]分别采用MP-SAT、实时定量聚合酶链反应检测315例患儿MP，发现两者具有较好的一致性，且SAT具有更高的特异性和敏感性。

目前，一般采用体外药物敏感性试验分析MP对大环内酯类抗菌药物的耐药情况，但由于MP培养条件苛刻，临床实验室一般无法常规开展。大环内酯类抗菌药物耐药性的产生多与23SrRNA结构域Ⅱ区和V区基因位点突变有关。目前临床上主要通过荧光定量聚合酶链反应和测序技术快速检测耐药性点突变进行耐药分析，如Sanger测序法和实时聚合酶链反应-高分辨率熔解曲线（polymerase chain reaction-high resolution melting，PCR-HRM）。最近有研究结果表明，有商业化试剂盒通过熔解曲线分析MP耐药突变，与测序法比较，敏感性和特异性均为100%[46]。美国疾病预防与控制中心也使用PCR-HRM检测在MP暴发流行中的大环内酯类耐药突变[47]，但很少有方法可以同时检测MP及其耐药性突变。有学者设计了一种实时定量聚合酶链反应方法，可以从临床标本中快速检测MP，并同时快速检测23SrRNA 3个常见的耐药突变[48]。LIU等[49]开发了一种循环探针法，利用RNA和DNA构成的嵌合cycling探针，可以快速检测出MP，并区分出耐药突变株，与传统聚合酶链反应有良好的一致性。

核酸扩增方法有助于更好地了解MP的流行病学特征，可为临床治疗提供一定的依据。但是目前尚无统一的检测标准，故还未常规应用于临床。我们仍需探索更适用于临床的MP检测方法，指导临床制定合理的治疗方案，获得理想的治疗效果。