碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌临床检测与治疗方案的发展及应用

王 粟， 赵 虎

（复旦大学附属华东医院检验科，上海 200040）

近年来，随着侵入性诊疗手段以及广谱抗菌药物等的大量使用，多重耐药（multidrug resistance，MDR）细菌的检出率呈现快速上升趋势，碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌（carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE）因耐药性强而广、传播快、感染病死率高而备受关注，被世界卫生组织（World Health Organization，WHO）列为全球耐药的紧急威胁[1-2]。为了有效预防和控制CRE感染，本期“碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌临床检测与治疗方案的发展及应用”专题汇集4篇论著和2篇综述，介绍了CRE的流行病学特征，并对CRE检测方法和对应治疗策略的优缺点进行了总结和比较，以期为临床CRE感染的预防和诊疗提供参考。

1 CRE国内外流行现状

中国CHINET细菌耐药性监测数据显示，2005年，碳青霉烯类抗菌药物对肠杆菌科细菌保持较高的敏感性，耐药率普遍低于1%；2017年，耐药率明显上升，达1.9%～20.0%，尤以肺炎克雷伯菌的耐药率增长最快（由2005年的0.4%增长到2017年的20.0%）[3]。不同菌种的CRE发生率也有所不同，美国CRE的发生率分别为：肺炎克雷伯菌 11%，大肠埃希菌2%，相关病死率为40%～50%[1]；欧洲肺炎克雷伯菌中碳青霉烯类耐药株的检出率为37%，大肠埃希菌中碳青霉烯类耐药株的检出率为19%[4-5]；我国CRE的检出率则快速增加，最高可达15%，患者定植或感染CRE会直接增加住院时长及感染病死率，总体病死率达34%，其菌种构成以肺炎克雷伯菌（74%）为主[6]。

2 CRE的实验室检测方法及应用

CRE最常见的耐药机制是产碳青霉烯酶，其次是高表达超广谱β-内酰胺酶（extendedspectrum β-lactamase，ESBL）或头孢菌素酶（ampicillin，AmpC）合并膜孔蛋白突变，而药物靶点改变和主动外排系统过表达导致的碳青霉烯类耐药则较为少见[7]。因此，除了体外药物敏感性试验外，目前的CRE检测方法大多通过检测是否产碳青霉烯酶来判断CRE菌株。周宏伟等撰写的《碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的检测方法》从表型筛选、基因检测和基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技术等方面概述了近十种临床检测CRE的方法：传统的纸片法初筛操作最简便，但因菌种和耐药机制不同需选用不同的药物敏感性试验纸片[8]；显色筛选培养基筛选法结合特异性的显色酶底物及特定的碳青霉烯类抗菌药物和抑制剂鉴定菌种，但该方法的敏感性和特异性易受显色培养基中抗菌药物和抑制剂浓度影响[9]；美国疾病预防与控制中心（the Centers for Disease Control and Prevention，CDC）推荐的肉汤富集法和改良法将抗菌药物与肠杆菌科细菌同时置于肉汤中培养过夜[10]，再结合改良Hodge试验和MALDI-TOF MS鉴定结果确证CRE，结果可靠，但操作繁琐。

美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）在2015年推荐了Carba NP试验（Carba NP test，CNPt）[11]，基于细菌抽提物水解亚胺培南可改变溶液pH值的原理检测CRE，该方法快速、成本低，无需大型设备，但需配制特定试剂，可同时检测多种碳青霉烯酶，但仅适用于肠杆菌科细菌，且对染色体编码的OXA型碳青霉烯酶的检测敏感性低，也易出现假阳性结果。CNPt是通过检测产酶菌株水解对应抗菌药物发生的生化反应来验证菌株是否产酶。有学者参照这一原理建立了Polymyxin NP实验来筛查肠杆菌科中的多黏菌素耐药菌株[12]。唐瑜等撰写的《Polymyxin NP实验筛查肠杆菌科多黏菌素耐药菌株临床评价》从体外药物敏感性试验、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增多黏菌素耐药相关基因、实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）检测多黏菌素耐药相关的双组分调控元件等多方面综合评估了Polymyxin NP实验筛查多黏菌素耐药肠杆菌科细菌的临床价值，发现该方法操作简便，测定快速，结果可靠，可用于各种机制介导的多黏菌素耐药肠杆菌科细菌的临床筛查，可及时指导临床抗感染治疗。

改良碳青霉烯灭活试验（modified carbapenem inactivation method，mCIM）是2017年CLSI在经典的纸片筛选及协同试验基础上作出的改进，mCIM将待检菌株与10 μg美罗培南无菌纸片置于2 mL TSB肉汤共同孵育4 h后，立即将美罗培南纸片取出贴于已涂布有大肠埃希菌（ATCC 25922）的M-H平板上，孵育过夜后测量抑菌圈直径，通过判断菌株是否产碳青霉烯酶进而判别CRE。2018年，CLSI再次更新了相关内容，补充了mCIM阳性菌株可再联合乙二胺四乙酸改良碳青霉烯灭活试验（ethylenediamine tetraacetic acid-modified carbapenem inactivation method，eCIM）的结果区分产金属β-内酰胺酶和丝氨酸碳青霉烯酶，以更有针对性地指导临床用药[13]。李世荣等撰写的《双浓度联合改良碳青霉烯灭活试验筛查CRE的临床应用价值》创新性地评估了双浓度联合mCIM筛查CRE的可行性及临床应用价值。该研究分别配制终浓度为2 μg/mL和4 μg/mL的含美罗培南标准液的TSB肉汤，孵育过夜后转种中国蓝琼脂平板，检查菌落生长情况及菌落形态，如果2个浓度均不生长，则为CRE阴性；2个浓度均生长，为CRE阳性；若2 μg/mL浓度生长、4 μg/mL浓度不生长，则需要进一步做mCIM确认CRE。以仪器法分析结果为参考，双浓度联合mCIM方法筛查CRE的符合率、敏感性和特异性均高于98%。总体来说，mCIM易操作，无需特殊设备，且能分辨多种碳青霉烯酶基因型，进而细化临床用药指导，适合在各种医疗机构的临床微生物实验室中推广使用，但仍然存在耗时长等缺点[14]。

近年来，基因测序等分子生物学技术快速发展与普及，其在临床微生物实验室的应用也越来越广泛，最有代表性的就是通过检测耐药基因快速鉴别CRE[13，15]。周宏伟等撰写的《碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的检测方法》特别阐述了环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术可直接检测各种临床送检样本中的耐药基因，在68℃条件下特异性扩增KPC基因，且不产生其他β-内酰胺酶基因的非特异性扩增，灵敏度可达100 CFU/mL，是普通PCR的10倍，检测时间也仅需25 min；另外，还有一种基于实时荧光PCR的高灵敏度检测方法Xpert Carba-R，可同时快速检测KPC、NDM、VIM、IMP和OXA-48等多种碳青霉烯酶基因，正确率超过97%，但对设备有特殊要求，且耗材成本较高。何丽华等撰写的《RT-PCR快速检测产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌临床应用评价》评估了一种国产试剂盒——肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类抗生素KPC基因检测试剂盒（荧光PCR法）的性能。该研究采用RT-PCR方法直接检测临床样本和菌株中肺炎克雷伯菌外膜磷脂蛋白基因blaphoE和碳青霉烯酶基因blaKPC，用于鉴定和确认耐药基因，同时进行传统细菌培养和体外药物敏感性试验，发现RT-PCR鉴定肺炎克雷伯菌的灵敏度为100%，特异性为99.38%，与传统细菌培养法的符合率为99.56%；KPC基因检测的灵敏度为95.56%，特异性为99.48%，与体外药物敏感性试验的符合率为98.67%。该试剂盒检测仅需2～3 h，高效、简便，可快速筛查产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌，可为重症感染患者快速提供抗感染治疗的依据。总体来看，基于PCR的分子检测技术与传统的细菌培养和体外药物敏感性试验相比，具备耗时短、敏感性和特异性高的独特优势，有助于早期、快速明确CRE感染，帮助临床及时、合理用药，但PCR也存在不足：仅能对已知的编码基因进行扩增，而对目前尚未发现的基因型无法进行预判[16]；若该菌存在未知或罕见的耐药基因，则会导致CRE检测结果呈假阴性；且PCR价格昂贵，需要特定设备，对操作人员也有一定的技术要求；后续分析如体外药物敏感性试验指导用药仍需依赖传统的培养方法[1]。

3 CRE治疗方案

CRE菌株因其耐药谱广，通常对所有的β-内酰胺类抗菌药物耐药，可供选择的抗菌药物有限[5，7]，临床大多采用联合用药方案，但疗效不佳[16]。考虑到细菌产生各类β-内酰胺酶是造成肠杆菌科细菌对碳青霉烯类耐药的主要原因[5]，国内外研究者们开始对β-内酰胺酶抑制剂尤其是新型抑制剂的开发进行了广泛研究。阿维巴坦（avibactam，AVI）是一种新型的非β-内酰胺类的β-内酰胺酶抑制剂，2015年在美国获批，与三代头孢菌素——头孢他啶（ceftazidime，CAZ）组合上市，与临床常用的抑制剂舒巴坦等相比，AVI具有抑酶效果更好、抑制谱更广的优点，该复合制剂对革兰阴性杆菌感染有着良好的治疗效果[17]。陈涛等撰写的《头孢他啶/阿维巴坦单独和联合磷霉素对碳青霉烯类耐药革兰阴性菌体外抗菌活性研究》探究了这种新型β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂复合剂——CAZ/AVI联合磷霉素对碳青霉烯类耐药革兰阴性菌的体外抗菌活性。结果表明，CAZ/AVI联合磷霉素在体外对碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌表现出协同作用，不存在无关和拮抗作用，证实了该联合方案可通过AVI靶向抑制β-内酰胺酶，CAZ和磷霉素可以无阻碍地破坏细菌细胞壁，以2种不同的策略杀死细菌；唯一的局限是该方案对产金属β-内酰胺酶的CRE缺乏有效作用。

有研究证实，CRE定植以直肠定植为主，是患者发生CRE感染的独立危险因素，定植进展为感染的总体风险高达17%，感染病死率也会随之上升；目前全球普遍存在CRE定植的情况，不同的医疗机构中CRE定植率在0.3%～5.0%[18-19]，在临床治疗CRE感染之前，对CRE定植的患者实行有效的去定植方案也是降低CRE感染率的必要手段[20]。邹成韵等撰写的《碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌去定植策略研究现状》主要阐述了以预防CRE定植进展为感染的去定植策略，包括选择性消化道净化与粪菌移植技术，列举了2种去定植手段的优缺点以及未来需要集中解决的问题。目前主流的去定植方法是口服氨基糖苷类抗菌药物、多黏菌素E或两者的组合，最高可将定植肺炎克雷伯菌进展为感染的风险降低80%[21]。尽管目前关于选择性消化道净化的研究较多，且已证实对于CRE去定植有一定的效果，但其临床普及率却不高，部分国家只在重症监护病房零星使用[22]。有研究发现粪菌移植实行1周后37.5%的患者无CRE定植，3个月后50%的患者无CRE定植，表明去定植效果良好，但考虑该试验样本量较小，且目前相关研究还较为缺乏，粪菌移植去定植CRE的临床可行性和安全性仍需要更大的随机和队列研究验证[23]。

4 总结

CRE是当前最受国内外关注的耐药性威胁之一，在我国的流行状况也异常严峻，因此快速、准确地检测CRE，及时选择合适的抗感染治疗方案对于降低感染率至关重要。随着各种新技术、新方法的开发和普及，尤其是MALDITOF MS等技术的应用，临床微生物实验室已经可以快速检测出耐药菌株，明确鉴别CRE，为临床感染性疾病的预防及诊治争取宝贵时间。但是不同的检测方法对不同菌种、不同耐药基因的检测灵敏度不同，没有一个单一且理想的方法可以覆盖所有的耐药基因，全面地指导临床用药。目前对CRE感染的治疗尚无国际统一的有效方案，需结合本地区菌株流行特征、药物敏感性、定植与否及抗菌药物特点等因素综合考量。本专题的6篇文章，从检测和治疗的不同角度分别阐述了CRE实验室诊断方法以及相应的治疗策略，为临床CRE感染的治疗及防控提供了参考依据。希望本专题能帮助读者更好地了解CRE检测技术及防控策略，更好地服务临床。