医学检验技术在新型冠状病毒肺炎诊疗中的应用

安 娜，俸家富

西南医科大学附属绵阳市中心医院检验科，四川绵阳 621000

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是由一种新型β属RNA冠状病毒(CoV)引起的肺炎[1]。2020年2月11日，国际病毒分类学委员会将这种新型CoV命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。

SARS-CoV-2具有极强的传染性，主要经呼吸道飞沫传播(喷嚏、咳嗽)和接触传染，存在经气溶胶传播的可能，人群普遍易感。SARS-CoV-2不仅潜伏期长、传播速度快，而且感染早期临床症状不典型、起病隐匿，易影响双肺。因此，早期难以发现、容易漏诊和误诊。随着病情的加重，患者主要表现为发热、乏力、干咳，少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛和腹泻等症状，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)[2-3]。除中国外，SARS-CoV-2很快传播至全球，包括澳大利亚、法国、日本、马来西亚、美国、越南等[4]近30个国家和地区，成为世界性的公共卫生问题。

感染性疾病的诊断必须以病原学检测结果为依据，此次极其严重的COVID-19疫情也不例外。快速研发的核酸检测试剂盒为确定疑似病例是否为确诊病例提供了最直接的证据，尽早检测对于疫情防控具有重要作用，给疫情的遏制带来了希望，但因其假阴性率较高也引起了一些疑虑。而对疾病的处理，不仅要依靠正确的诊断，还需要精准的治疗和对预后的判断。此次疫情让更多人认识到检验科“看不见的医生”在诊疗中所起的作用及检验技术不可或缺的重要性，同时也了解到医学检验在疾病诊疗中的重要性。

1 COVID-19诊断的“金标准”

传染性疾病，尤其烈性传染性疾病，准确、快速地检测出病原体对于患者的早发现、早报告、早隔离和早治疗极为重要。没有病原学检测报告作为支撑，感染性疾病较难进行确诊。病毒诊断的“金标准”是在实验室中完成病毒的分离[5]，在武汉疫情初期，中国疾病预防控制中心应用基于二代测序(NGS)的宏基因组学技术，在短时间内完成该病毒相对丰度的鉴定，并获取了全基因组序列[6]。在SARS-CoV-2基因组序列公布后，实时荧光反转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂被快速研发[7]，截至2020年2月底，我国已有20多种用于SARS-CoV-2临床诊断的商业试剂盒，RT-PCR检测阳性成为COVID-19的病原学确诊标准之一。另一种病原学确诊的标准是“病毒基因测序，与已知的SARS-CoV-2高度同源”。

1.1NGS NGS具有测试速度快、通量高、信息量大、准确率高和成本低等优势[8]。NGS不仅可对标本中未知基因组序列进行测定和鉴定，用以确认未知病原体基因组信息，而且可用于未知感染性疾病宏基因组学分析和传染病监控。利用NGS，中国疾病预防控制中心在武汉疫情初期很快就获得了SARS-CoV-2的全基因组序列，发现该病毒与蝙蝠CoV序列有96%的相似性，与严重急性呼吸综合征(SARS)病毒序列有79.5%的相似性，确定为β属CoV[9]。该研究为SARS-CoV-2的溯源、临床诊断及治疗方案制订提供了科学依据，为后续进行COVID-19的病原学、免疫学和流行病学研究奠定了坚实基础。但由于NGS对实验室环境、装备和人员素质的要求较高，且耗时长、价格昂贵，不适合用于SARS-CoV-2的临床常规检测。因此，SARS-CoV-2的“核酸检测”几乎成为COVID-19的“唯一”确诊标准。

1.2核酸检测 目前用于SARS-CoV-2的核酸检测技术主要为RT-PCR。已在临床实验室应用多年的RT-PCR技术，其检测体系成熟，不仅具有特异性强、灵敏度高、检测周期短和可定量检测的优点，而且还能对病毒感染程度和治疗效果进行动态监测。然而，RT-PCR在SARS-CoV-2检测应用中因阳性率低的问题，其检测准确性受到较大质疑。造成阳性率低的原因可能主要有以下几点。

1.2.1标本的选择与采集 根据国家卫生健康委员会颁布的《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》[10]，用于SARS-CoV-2检测的标本类型有上呼吸道标本(如咽拭子、鼻拭子等)、下呼吸道标本(如呼吸道吸取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、深咳痰液等)、眼结膜拭子、粪便标本和抗凝血标本等，何种标本是最适标本(即阳性率最高)，至今还在探索之中。另外，SARS-CoV-2感染病程转归并不完全清楚，采样最佳时机还不确定，若标本中病毒载量浓度低于检测限时，不可避免会产生假阴性结果；再者，目前实验室检测结果表明下呼吸道标本SARS-CoV-2核酸检出率更高[11]，而《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第六版)》[2](以下简称“《诊疗方案》”)推荐的首选核酸检测标本是痰液，但临床送检的多数为上呼吸道标本，以及标本采集质量的差异，都将不可避免地导致结果为假阴性。

1.2.2RNA不稳定性 RNA病毒核酸稳定性较差，易受环境条件和实验器材等诸多方面影响而自行降解，易导致假阴性。

1.2.3试剂盒质量 已有研究证实，SARS-CoV-2基因组结构自上而下依次由5′非翻译区 (UTR)、转录酶复合物(orf1ab)、S基因、E基因、M基因、N基因和3′UTR及几个未知非阅读编码框序列组成[12]。采用RT-PCR检测SARS-CoV-2核酸就需按此特定结构进行引物设计。理论上，检测的靶标越多，其灵敏度就越高。但实际研发中，靶标越多，引物和探针的设计就越复杂，这无疑给方法设计和产品加工增加更大难度。根据美国疾病预防控制中心的推荐，特异度最高的orf1ab为确诊靶标，E基因是一线筛查靶标，N基因是附加确诊靶标[13]。因此，现有SARS-CoV-2核酸检测试剂盒根据靶标可分为单靶标(orf1ab)、双靶标(orf1ab+N基因/E基因)和三靶标(orf1ab+N基因+E基因)。靶标设计的不完全，自然就会导致检出率下降。此外，应急研发生产的SARS-CoV-2检测试剂盒缺乏完整的临床应用验证和方法学验证，扩增区突变和试剂批间差异可导致结果假阴性；另外，RNA提取方法所用检测试剂缺乏质量保证，通常用于扩增的标本量是以体积计算而非RNA拷贝数来衡量，现有检测试剂盒的检测下限多数是500 copy/mL，个别是200 copy/mL，如果标本中RNA水平更低，可能影响最终的扩增效果，导致结果呈假阴性。

此外，还有很多影响SARS-CoV-2检测分析前、中、后的因素，如采样时期、标本保存与运送、实验室操作和结果判断与解读，任何环节出现问题均可导致结果不可靠。

2 非“金标准”的实验室检测指标

针对RT-PCR对COVID-19病原学确诊标准灵敏度较低和准确性差的缺点，临床医生和实验室工作人员必然要对“非核酸检测”之外的实验室指标加以关注和重视。

2.1辅助诊断 COVID-19由SARS-CoV-2感染所致，患者血常规指标与其他病毒感染有相似的变化特征，即COVID-19发病早期外周血中白细胞计数正常或减少，淋巴细胞计数减少，多数患者C-反应蛋白(CRP)和红细胞沉降率升高，降钙素原(PCT)正常，在继发感染患者中PCT水平会升高(0.5 ng/mL)[14-16]。

人体感染病毒后，免疫系统会产生抗体，IgM是机体感染后产生的早期抗体，提示现阶段被感染的状态；而IgG抗体在感染中晚期出现，滴度出现持续增高，并在血液循环中存在较长时间，提示既往存在感染[17]。因此，检测特异抗体也可以明确患者是否“近期或既往感染”SARS-CoV-2，有助于核酸检测阴性但临床上疑似患者的确诊。

2.2疾病严重度判断 《诊疗方案》中指出，COVID-19重症患者D-二聚体(D-D)水平升高、外周血淋巴细胞进行性减少[2]。D-D水平可反映血液凝集状态，而SARS-CoV-2感染的重症患者会出现凝血功能障碍，发生ARDS后，D-D水平会有不断升高的表现[14]，医生可根据D-D水平掌握病情进展情况。

淋巴细胞是机体免疫系统执行免疫功能、发挥细胞免疫和体液免疫的物质基础。外周血中淋巴细胞进行性减少，提示患者免疫功能逐渐下降[18]，病情更加严重。

因此，临床医生可监测COVID-19患者血浆D-D水平和外周血中淋巴细胞数量，分析判断患者病情的严重程度，掌握疾病进展情况，必要时及时调整治疗措施或采取针对性的治疗方案。

2.3鉴别诊断 根据中东呼吸综合征(MERS)的诊断经验，MERS-CoV在感染早期较易漏诊，其临床表现与甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒和鼻病毒等引起的社区感染性肺炎相似，而大多数MERS-CoV感染在医院内暴发都与诊断延迟有关[19]。SARS-CoV-2感染所致COVID-19的临床特征也与普通病毒性肺炎相似[15]。进行呼吸道病原体的检测可以很好地将SARS-CoV-2与流感病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒等已知病毒性肺炎进行鉴别，甚至还可与支原体、衣原体肺炎鉴别。即使是COVID-19确诊患者，也能判断其是否合并有其他病原微生物感染，给治疗决策提供可靠的病原微生物检测依据。相反，若呼吸道病原体检测全部呈阴性，而临床表现又具有病毒性肺炎的特征，即使SARS-CoV-2核酸检测呈阴性，也能提示临床医生对此类患者应持以高度警惕。

COVID-19重型患者在发病1周后出现呼吸困难[2]，而肺栓塞患者也多有呼吸困难发生，但是肺栓塞时血浆D-D呈阴性，对于门诊的一般发热患者，D-D的阴性检测结果可用于肺栓塞的排除诊断。因此，D-D呈阴性，既能预示COVID-19患者疾病严重度较低，也能提示医生该患者没有合并肺栓塞。此外，B型钠尿肽(BNP)/N末端B型钠尿肽(NT-proBNP)是诊断心力衰竭的首选指标，通过检测BNP/NT-proBNP，可以帮助患者排除因心力衰竭导致的呼吸困难。

2.4疗效监测 COVID-19患者确诊后的治疗监测，除影像学外，最直接、快速地反映治疗方案是否合理的证据就是实验室检测指标。根据《诊疗方案》，SARS-CoV-2感染可分为轻型、普通型、重型和危重型。重型和危重型患者多伴有肝、肾、心脏和凝血系统损伤等多器官、多系统的急性损伤甚至衰竭[2]。因此，SARS-CoV-2感染者常常通过高频次检测相关血液体液指标，以监测疾病进展情况，适时调整处理和治疗方案，避免病情恶化。

2.4.1心肌损伤监测 《诊疗方案》中明确提出了将心肌肌钙蛋白(cTn)和肌红蛋白(MYO)作为COVID-19患者疾病监测指标[2]。而MYO水平在心肌损伤后1.5 h即可增高，有助于早期诊断。cTn是心肌损伤时血清中出现的特异性标志物，病情较为严重的COVID-19患者，因呼吸系统受损，氧合不足，导致心肌缺血性损伤，引起血液中cTn水平增加[16]。

COVID-19重型病例多在1周后出现呼吸困难，严重者快速进展为ARDS、感染性休克、凝血功能障碍，引发肺外各系统损害。BNP/NT-proBNP和D-D水平检测可鉴别呼吸困难是心源性或肺源性，患者是否有肺栓塞存在。因此，有学者建议采用新的“心脏3项”(包括cTn、BNP/NT-proBNP和D-D)作为心肌损伤诊断的标志物，原因为新的3项指标可综合反映心脏结构变化、心脏功能变化，并从病因学和病理生理学两个方面整体评估心脏结构和功能的改变[14]。因此，“心脏3项”首先用于胸痛和呼吸困难初步评估，鉴别和排除是否存在心肌梗死、肺栓塞和心力衰竭，以便进一步对患者进行风险评估，进而根据风险分层实施精准治疗，观察疗效，还可对患者预后进行评估。

2.4.2肝、肾功能损伤监测 重症、危重症COVID-19患者大多数都存在肝脏和(或)肾功能损伤[14]，因此，SARS-CoV-2感染患者一旦确诊，无论疾病程度轻重，均需要常规性地监测患者肝、肾功能，以降低患者并发症的发生风险[2]。已有研究表明，COVID-19患者血清乳酸脱氢酶(LDH)水平明显升高，而清蛋白(Alb)水平降低；部分患者血清肌酐(SCr)水平增高[14]。由于对SARS-CoV-2的认识尚在探索之中，因此，感染者即使确诊后也以对症治疗为主，仍然有不少患者发展成重症和危重症，很快发展为ARDS[2]。由于个体差异，一些患者难免出现继发感染，引发肺外系统疾病如肝、肾功能损伤和呼吸衰竭。有研究报道，在MERS疫情期间多达50%的病例有急性肾损伤[19]。但是，监测肾功能早期损伤的SCr并非是首选标志物，急性肾损伤应选中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白和胱抑素C，慢性肾损伤应选肾小球滤过率和尿Alb与尿肌酐比。

2.4.3细胞因子风暴综合征(CSS) 细胞因子是免疫原、丝裂原等刺激诱导多种细胞产生的一类相对分子质量低于30×103的可溶性蛋白，在细胞间的信息传递过程中起重要作用。肺内细胞因子经刺激产生或自分泌后，经肺泡上皮细胞、间质细胞、成纤维细胞及血管内皮细胞等放大作用产生更多的细胞因子，形成“瀑布”效应，即细胞因子风暴。因此，当机体受病原微生物感染后，CSS刺激免疫系统，短时间内释放大量炎性介质入血，从而导致全身性炎症反应综合征的发生，引起多器官损伤、衰竭和ARDS等疾病[20]。HUANG等[14]对SARS-CoV-2感染患者的早期观察研究中阐述了CSS，并且从细胞因子水平论述了COVID-19与SARS的不同之处，为临床诊疗提供了较高的价值。SARS-CoV-2感染者容易出现CSS，导致肺组织大量释放炎性因子，同时肺发生纤维化，从而导致缺血、缺氧。有研究证实，CSS发生可导致肝衰竭、心力衰竭、急性肾损伤和凝血功能障碍等多系统、多器官病变[15]。凝血激活可能会导致弥散性血管内凝血(DIC)和静脉血栓栓塞症(VTE)。因此，对于COVID-19患者，尤其是重危症患者进行多系统、高频次的实验室指标监测，以防止CSS进一步导致多系统、多器官急性损害的发生极为重要。

由此可见，SARS-CoV-2感染后除监测患者血常规、尿常规、CRP、肝功能、肾功能、凝血功能、心肌损伤标志物、动脉血气等外，还应该监测患者炎性细胞因子，如白细胞介素(IL)-2、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-6、干扰素(IFN)-γ等[2]，如果细胞因子水平出现增高，需严防CSS的发生，以及进而引发的患者器官损伤甚至衰竭。

2.4.4凝血功能障碍 COVID-19患者D-D水平增高，严重者发生出血和凝血功能障碍[2]。活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间、凝血酶时间和纤维蛋白原常称作凝血4项，为凝血功能相关疾病的筛查指标，但其对凝血过程进行分解检验，不能反映凝血整体过程，其结果与临床常有不符。纤维蛋白原降解产物与D-D在辅助诊断DIC和深静脉血栓等疾病时较凝血4项更有价值，但受其他可能导致纤维蛋白降解的因素影响，对纤溶亢进的检测特异度较低。血栓弹力图检测能对患者发生血栓风险进行准确评估，准确诊断继发和原发纤溶亢进。抗凝血酶、蛋白C和蛋白S可监测易栓症和静脉血栓栓塞症的形成。

SARS-CoV-2感染的重症患者与危重症患者在发病1周后出现呼吸困难和(或)低氧血症，严重者快速进展为ARDS、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和凝血功能障碍[2]。因此，血气分析也在COVID-19患者危重程度分级及治疗监测方面有极大的指导价值。

对于COVID-19患者，尤其是重症患者与危重症患者实施多系统、多方位的监测，可更好更准地实现对疾病病情的监控，进而实施精准治疗。

2.5预后评价 重症肺炎会导致患者多器官衰竭，增加心脏负担，心肌损伤是COVID-19的常见并发症之一，特别是重症患者，根据血清中cTn水平可对患者的心肌损伤程度和预后风险作出判断。患有心脏基础疾病的患者，较易发生心力衰竭等恶性事件，BNP/NT-proBNP的检测可用于确诊和排除诊断，还可评估急性冠状动脉综合征的危险分级及心脏功能，并可对预后进行判断。COVID-19患者较易发生肝脏和(或)肾脏损伤，检测肝功能指标如天门冬氨酸氨基转移酶、总胆红素、Alb等可对预后进行判断，肾功能预后评估仍依赖于尿蛋白定量，ARDS和年龄是急性肾功能不全的重要危险因素，而急性肾功能不全是预测病死率的独立危险因素[21]，有效的肝、肾功能监测和预后评估对于延长患者生存期有重要意义。

此外，血清中IL-2R和IL-6表达水平可预测COVID-19患者的病情严重程度和预后情况[15]。CRP可反映由病毒引起炎症的严重程度，并且与肺部的免疫病理损害有关，其水平升高增加了呼吸衰竭和死亡的风险，因此预示了不良的预后[22]。CRP和PCT检测也可评价合并细菌感染患者的预后情况。而IgM作为感染早期抗体，其滴度与呼吸道感染症状的严重程度密切相关，也可间接反映病毒在体内的增殖情况，IgM的检测对预后判断也有一定帮助。

3 总 结

基因测序与核酸检测可提供诊断COVID-19的依据。而患者治疗则依赖除此之外的“非核酸检测”指标。此次疫情中，核酸检测技术在疾病诊断中的重要性已显而易见，但在对确诊患者实施精准治疗中，需要对“非核酸检测”指标进行及时、准确的监测，才能正确选择药物、确定疗效、评估预后，进而遏制病情恶化，使患者得以早日康复。