新一代肿瘤标志物循环肿瘤细胞的研究进展

陈 菲，周小越，白日兰，崔久嵬

(吉林大学第一医院肿瘤中心，吉林 长春130021)

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)最新定义为从恶性肿瘤原发部位或转移灶脱落，通过血管或淋巴系统进入血液循环的细胞，CTCs能反映肿瘤发生发展情况，并可通过无创方式和动态监测对肿瘤进行病理诊断、分子测序、疾病监测和判断预后等[1]。近年来许多研究[2-4]证实：存在于外周血中的CTCs与肿瘤转移有密切关系，随着检测技术的逐步进展，CTCs在恶性肿瘤患者诊断、治疗效果和预后预测方面的意义受到越来越多的关注。

1 CTCs的生物学特性

1.1 CTCs的表型和亚群分类CTCs可因表型不同而分为几个亚群，如上皮型CTCs、间质型CTCs、上皮-间质混合型CTCs和肿瘤干细胞样CTCs(cancer stem cells, CSCs)。上皮-间质混合型CTCs兼有上皮细胞和间质细胞特性，CSCs具有自我更新能力和多向分化潜能，这可能是肿瘤复发和转移的根本原因[2，5]。CTCs黏附是肿瘤转移的关键步骤，有研究者[6]利用开放式微流控技术分析3种类型单个CTCs(脑胶质瘤U87 CTCs、结肠腺癌Caco-2CTCs和肝细胞癌HepG2CTCs)在血管内皮细胞(endothelial cells, ECs)上的黏附性，发现不同表型CTCs对ECs的黏附程度相差明显，且HepG2CTCs的黏附能力最强。上皮型CTCs黏附于血管内皮通过上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)进入血管成为混合表型CTCs，其经历了机械损伤、细胞凋亡和免疫系统识别杀伤后，到达外周血时仅占外周血白细胞的 1/107～1/106[7]。上皮-间质混合型CTCs再通过间质-上皮转化(mesenchymal-epithelial transition, MET)从血管侵入组织形成新的转移灶[8]，同一疾病的不同进展阶段，CTCs表型亦存在明显差异，且其远处转移的潜能和器官偏好性不同[9]。 CTCs具有聚集成团的特性，多个CTCs可形成循环肿瘤微栓(circulating tumor microemboli, CTM)和CTCs簇(CTCs cluster)，二者均比单个CTCs的存活和转移能力更强，标志着肿瘤的高度转移潜能[10]。

1.2 血小板对CTCs存活的影响研究[11-12]显示：血小板可能参与CTCs的形成、存活和转移等环节。CTCs表面具有与血小板结合的受体或配体，如整合蛋白αvβ3和CD44等，可直接或间接地激活血小板，血小板表面黏附分子αⅡbβ3的抑制剂可减少肺癌CTCs在血管壁定植。在整合蛋白、黏附分子和选择素(P-选择素和L-选择素)等的参与下，CTCs在血液中与纤维蛋白原、血小板及白细胞等形成聚合物即癌栓，逃避血流剪切损伤及免疫杀伤，并在血流中通过逐步黏附而减速直至在血管壁定植，进入组织器官形成转移[13]。故血小板可能参与CTCs形成、存活和转移等环节，研制新型靶向药物阻断CTCs与血小板之间的相互作用有可能在一定程度上阻止肿瘤的复发和进展。

1.3 免疫细胞对CTCs免疫逃逸的影响CTCs表面广泛表达生存素是一种抗凋亡蛋白[14]，生存素-3B亚型可以封闭自然杀伤(natural killer, NK)细胞 的细胞毒作用而使肿瘤细胞逃避免疫识别[15]。CTCs的免疫耐受和生存优势很大程度上与其周围免疫环境有关。诱导性调节性T细胞(induced regulatory T cells, iTregs)可由肿瘤诱导产生，抑制免疫细胞对肿瘤的清除，促进肿瘤生长[16]。髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)促进自然调节性T细胞(natural regulatory T cells, nTregs)增多，并通过白细胞介素10(interleukin-10, IL-10)、转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)和CD40-CD40L间相互作用等使iTregs增加，也可通过TGF-β的细胞接触依赖机制或识别NK细胞受体NKp30及NKG2D来抑制NK细胞毒作用及干扰素γ(interferon-γ, IFN-γ)的产生[17]。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4, CTLA-4)和程序性细胞死亡受体1(programmed cell death receptor 1, PD-1)是重要的免疫负调控分子，CTCs表面配体与免疫细胞表面受体结合可抑制免疫细胞活性，减弱免疫细胞对肿瘤的杀伤作用，且CTCs表面程序性细胞死亡配体1(programmed cell death ligand 1,PD-L1)的表达水平呈动态变化[18]，这些免疫细胞在外周血中数量、功能状态及表面受体表达可能对CTCs的免疫耐受及生存起决定性作用，可促进远处转移的形成。未来应开展更多有关CTCs与免疫治疗的研究。

2 CTCs的富集、检测和分析方法

由于CTCs数量稀少且表面标志物表达的差异，需要利用多种技术对其筛选和鉴定。临床实践中富集和检测CTCs的技术方法主要有两大类：①利用CTCs的物理特性，如CTCs大小、密度和电荷等将CTCs与血细胞分离；②在蛋白质分子水平利用CTCs表面的特有分子以区分肿瘤细胞和血细胞，通常基于抗原抗体反应的原理。获取CTCs后，还可对其进行核酸分子水平的深入分析，检测CTCs表达的mRNA或分析CTCs全基因组信息，主要利用逆转录多聚酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)和二代测序技术(next-generation sequencing, NGS)。

2.1 CTCs的物理富集方法利用CTCs密度、体积大小、细胞刚性和电性能等物理性质与血细胞不同，可实现对CTCs初步筛选，其中最常用的是根据CTCs密度低于血细胞的密度梯度离心法与根据CTCs直径大于血细胞的膜滤过分离法(ISET)。此外，因CTCs表面积更大，导致CTCs的膜电容较高，可通过双向电泳法分离CTCs[19]。因CTCs具有更高的质核比，还可通过筛选具有高质核比特征的细胞进行CTCs富集[20]。新开发的柔性微弹簧阵列(flexible micro spring array, FMSA)装置[21]采用创新设计，无需对血样预处理即可快速富集活的CTCs，并在10 min内即对CTCs行下游分析，降低了操作过程对CTCs的破坏和对CTCs表型的改变，不仅可富集单个CTCs，还可富集CTCs簇；另一种富集CTCs簇的技术为Cluster-Chip[22]，此微流控芯片技术通过特定的分支诱捕器，从未经处理的血液中捕获具有完整细胞群的CTCs簇，即使是2个细胞组成的CTCs簇也能够被有效捕获。对分离的CTCs簇进行下游分析，可有助于理解CTCs簇的生物学特性及其在肿瘤发展中的作用，并为抑制肿瘤转移提供新的研究视角。物理富集方法的优点是操作简便、价格相对低、对CTCs活性影响小和便于进行下游分析，避免遗漏具有特定免疫标识的CTCs，从而使富集到的CTCs种类更全面；但仍有一些物理特性与CTCs相似的血细胞会混杂其中，导致分离得到的CTCs纯度不高，计数难度大。因此，迫切需要开发高性价比的CTCs检测技术，便于基础研究和临床工作。

2.2 CTCs的免疫富集方法利用免疫亲和原理开发的CTCs富集方法较为常用，其利用特异性抗体与细胞表面抗原特异性结合来富集CTCs，根据捕获原理不同，可分为阳性富集和阴性富集。阳性富集主要根据CTCs表达的膜表面特异性标志物如上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)和细胞角蛋白(cytokeratin, CK)等，带有磁珠的抗体与CTCs表面抗原结合后，在磁场的作用下将CTCs与血细胞分离，后续再将磁珠与CTCs分离，但是该分离过程会遗漏间质型和EMT型等不表达上述标志物的CTCs，同时也会混入正常循环上皮细胞，导致假阴性和假阳性，富集到的CTCs活性受损，给下游分析带来困难。近年来，随着对肿瘤细胞表面叶酸受体(folate receptors, FRs)高表达的认识，利用CTCs表面FRs检测CTCs在肺癌中的应用逐渐增多[23]，利用PCR技术识别“配体-寡聚核苷酸偶和物”探针检测FRs阳性的CTCs，其灵敏度和特异度均较高。阴性富集是利用白细胞表面抗原如CD45的特异性抗体结合白细胞后将白细胞分离，间接筛选出全部类型CTCs，且CTCs未参与抗原抗体反应得以保留其完整特征以便进行下游分析，但该方法获得的CTCs纯度低，富集后剩余的背景白细胞干扰后续基因分析[24]。基于以上原理开发的技术主要有流式细胞术(flow cytometry,FCM)[25]、细胞搜索系统[26]和生物芯片技术[27]等。细胞搜索系统还可对CTCs簇进行分离检测。

2.3 基因水平上对CTCs的检测和分析除了检测CTCs表面标志物外，对血样中溶解的CTCs特异性mRNA序列通过RT-PCR技术逆转录为互补DNA序列并进行实时PCR扩增后，通过分析mRNA互补DNA序列从而确定CTCs的存在。正常人外周血中不表达上述mRNA，其存在常提示肿瘤基因高表达。mRNA在血液中极易被RNA酶降解，因此mRNA检测阳性即提示CTCs存在。该技术可在5×107个外周单核细胞中检测到1个肿瘤细胞[28]，灵敏度高；但RNA易被降解会致结果假阴性，且细胞裂解会影响下一步分析。取样时细胞污染、假基因干扰和肿瘤标志物在非肿瘤细胞内的非正常转录等因素均可能致假阳性结果。

当已经获取得CTCs后，可通过分离和溶解单个CTCs后获取基因组DNA，利用PCR技术行全基因组扩增，最后经NGs分析CTCs全基因组[29]，对肿瘤的认识可深入到分子层面，发现更多靶点基因和信号通路，最大限度地增加每个患者对药物选择的正确性。多位点置换扩增(multiple displacement amplification, MDA) 为目前最常用的全基因组扩增方法。MDA方法是利用枯草芽孢杆菌噬菌体phi29 DNA 聚合酶和具有核酸外切酶抗性的随机引物，在等温条件下进行扩增，覆盖度和均匀性较PCR法均明显提升[30]。MDA 的缺点主要是偏倚较大，ZONG 等[31]将MDA与常规PCR技术相结合，开发出MALBAC 技术以提高扩增的覆盖度和均匀度。JIANG 等[32]采用纳米塑胶CTCs 芯片联合激光捕获显微切割技术，研发出一种新型单个CTCs全基因组测序平台。高通量单细胞基因测序法检测CTCs有益于从基因水平上对CTCs进行全面分析，并可为肿瘤分子分型和个体化治疗提供更加精准的信息。

通过对CTCs检测方式优化的探索，一种新的技术被筛选出来，其将差相富集和瘤标免疫荧光染色与染色体荧光原位杂交(immunostaining-fluorescenceinsituhybridization, i-FISH)结合, 不依赖肿瘤上皮细胞表面标志物的表达, 对CTCs同时进行瘤标染色与i-FISH染色体计数的双重检测, 具有高灵敏度和高特异度，即SE-i-FISH技术[33]，但尚需更多高质量、多中心和大样本数据支持其应用于临床。

3 CTCs的临床应用

3.1 CTCs在肿瘤临床诊断中的应用CTCs检测作为液体活检的方式之一可早于影像学发现早期肿瘤。对肺癌的研究[34]证明：CTCs对肿瘤的早期诊断和分期判断具有重要意义。一项纳入168例慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)患者的研究比较了胸部CT和CTCs检测结果对患者临床诊断的不同影响，结果显示:5例患者外，周血中存在CTCs，而胸部CT检查未发现肺部小结节，随访监测1～4年后，患者胸部CT检查才发现肺部小结节，术后病理结果显示均为Ⅰa期肺癌[34]。肺部磨玻璃结节性质的判定对患者治疗与否和治疗方式的选择至关重要。CTCs的检测对结节性质的判断意义重大。研究[35]证明：在鉴别非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和肺部良性疾病时，配体靶向PCR技术检测FRs阳性CTCs比常用的肺癌标志物(CEA、NSE和CYFRA21-1)具有更高的敏感度和特异度，且CTCs与传统肿瘤标志物结合应用可提高对NSCLC诊断的准确性。此外，肺癌分期越高，患者体内CTCs计数也越高[35-36]。在其他部位肿瘤的诊断中，CTCs同样扮演重要角色，如胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)患者4 mL血液中> 3 个CTCs有助于区分患者的局限期和转移期[37]，食管癌Ⅲ-Ⅳ患者CTCs阳性表达率高于Ⅰ-Ⅱ患者[38]。转移性结肠癌进展的晚期阶段，患者CTCs的CSCs样表型表达水平逐渐升高[9]。CTCs计数和表型的转变能够辅助肿瘤的定性及恶性程度的判断，CTCs计数越多提示病灶临床分期可能越晚，可在一定程度上指导临床决策。

3.2 CTCs对肿瘤治疗效果评价的作用与常用肿瘤标志物和影像学检查比较，CTCs计数在用于评估抗肿瘤治疗的疗效更易被患者接受，因为CTCs血液取样方便，无辐射，特异度高，避免了影像学检查的滞后性。CTCs细胞核大小可揭示甚至预测疾病进展。关于前列腺癌[39]、胃癌[40]、胰腺癌[41]和NSCLC[42]的研究证明：CTCs基线数及其动态变化可评估化疗的敏感性和肿瘤复发风险。CTCs细胞核的大小与疾病的发展阶段有关。对前列腺癌患者的研究[43]发现：在转移性去势抵抗性前列腺癌(metastatic castration-resistant prostate cancer, mCRPC)患者中非常小核CTCs(very small nuclear CTCs, vsnCTCs)和小核CTCs(small nuclear CTCs, snCTCs)居多，且在具有内脏转移的患者中vsnCTCs计数更多，提示不仅CTCs计数是评价疗效的指标，且CTCs细胞核大小亦具有疗效评估意义，可能预测发生内脏转移的患者，但需要更大规模的前瞻性试验去验证该结果，vsnCTCs的生物学特点也需要深入探究，并研究其在检测和预测内脏转移中的应用价值。在免疫治疗中，CTCs也具有重要的应用价值和研究空间。研究[18]证明：CTCs表面PD-L1表达水平和PD-L1高表达(PD-L1 high) CTCs占CTCs总数的比例与抗PD-L1药物疗效呈正相关关系，PD-L1 high患者接受抗PD-L1治疗后预后更好。CTCs计数的动态变化可用于免疫治疗效果评估，且基线PD-L1 high CTCs≥20%可作为抗PD-1治疗中对可能受益的患者进行分层的生物标志物。CTCs与组织活检得到的肿瘤细胞共同表达免疫检查点，只需抽取患者外周血即可预测免疫治疗效果，避免了多次组织活检给患者带来的痛苦。未来需要更多的研究探讨CTCs表面免疫治疗靶点在临床应用中的潜在价值。

3.3 CTCs对判断患者预后的价值CTCs计数已被证明与肿瘤患者的总生存时间(overall survival, OS)呈负相关关系。监测mCRPC患者的CTCs计数[44]结果提示血液中CTCs >5个/7.5 mL的患者OS率低于血液中CTCs <5个/7.5 mL的患者。随着对CTCs与肿瘤患者预后关系认识的深入，2018年美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)指南已将CTCs列为乳腺癌预后评估工具，即乳腺癌患者外周血中存在CTCs提示预后不良。研究[45]显示：CTCs阳性的激素受体阳性乳腺癌患者5年后肿瘤复发风险是CTCs阴性患者的13倍。CTCs作为新型液体生物标志物，可辅助肿瘤危险分层和预测肿瘤复发风险，提示对于激素受体阳性的早期乳腺癌，若其CTCs阳性，则术后辅助治疗需要更积极的治疗手段和更长的疗程，但该结论尚有待更多高质量和多中心的临床研究证实。此外，CTCs表型也是患者的预后影响因素。CSCs(+)/部分EMT(+)CTCs计数高的患者对化疗不敏感，尤其是在人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)阴性的患者中，其无进展生存时间(progression-free survival, PFS)和OS更短[46]，所以CSCs(+)/部分EMT(+)CTCs是乳腺癌复发风险的独立预后影响因素。经化疗栓塞治疗的不可切除肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)患者中，EpCAM(+)CTCs计数越高，患者的存活率越低[47]。因此对具有上述CTCs特征患者的治疗手段是否要更积极也值得思考。未来，在对CTCs计数研究的基础上，尚需开展更多针对CTCs表型与肿瘤发展和治疗关系的研究，以探讨不同表型CTCs可能表达的受体可以作为特异性标志物在肿瘤发生发展中的生物学作用机制，从CTCs中鉴别出能够真正形成转移的亚群细胞，靶向甚至逆转侵袭性表型是肿瘤治疗的研究方向之一。

3.4 CTCs对个体化治疗的影响CTCs起源于实体肿瘤，监测CTCs可了解患者对药物的敏感性及其变化情况。一方面，CTCs携带的基因信息与肿瘤组织具有一致性，如组织活检证实为EGFR-T790M突变阳性的NSCLC患者， CTCs中同样存在该突变[48]，因此CTCs可能替代肿瘤组织活检指导靶向治疗。但另一方面，肿瘤细胞分化过程中，会产生具有显著异质性的亚克隆细胞群体，CTCs基因组与原发病灶基因组并非始终一致，如在一些HER-2阴性的乳腺癌患者外周血中发现HER-2阳性的CTCs[49]，这部分患者也可考虑使用曲妥珠单抗等针对HER-2位点的靶向药物进行治疗。因此可将CTCs检测作为组织活检的补充，在首次确诊肿瘤时可以利用组织活检指导治疗，而在后续跟踪疗效中可选择检测和分析CTCs替代组织活检指导药物选择。HER-2阴性、CSCs(+)、部分EMT(+)和CTCs计数高的乳腺癌患者对化疗不敏感[46]，对该患者采取其他治疗手段至关重要，如可采用针对CSCs、EMT(+)CTCs相关分子和途径的新型靶向疗法。将CTCs分离培养行体外研究可能发现肿瘤的原发和继发耐药分子机制，从而为发现新的治疗靶点提供信息，为研发新型靶向药物和选择精准合理的治疗方案提供切实的理论依据。

CTCs代表实体瘤的液体成分，是肿瘤残留负荷的替代性标志物。尽管CTCs状态是乳腺癌复发和死亡的预后影响因素，但关于其在指导临床治疗中作用的研究较少。研究[50]提示：HER-2的乳腺癌患者经过5年内分泌治疗后，CTCs计数增加代表肿瘤负荷较大，继续内分泌治疗可预防或延缓患者复发。目前早期乳腺癌患者接受术后放疗是否获益尚无有效的生物标志物可以预测。而最近研究[51]表明：CTCs状态可能对预测放疗是否获益有一定临床价值。研究[51]显示：接受保乳术的乳腺癌患者若CTCs呈阳性，术后放疗可明显改善患者的DFS、无局部复发生存时间(local recurrence-free survival, LRFS)和OS，这种生存获益可能与CTCs阳性患者具有较高局部残留病灶负荷或存在内分泌抵抗有关；而接受保乳术的CTCs阴性患者和接受乳房切除术的CTCs阳性患者是否接受术后放疗与预后均无显著相关性。这可在一定程度上指导乳腺癌临床治疗策略，并提示CTCs阳性与病灶残留可能相关，需进一步研究以阐明CTCs阳性与局部复发风险增加相关的潜在机制。此外，检测CTCs中肿瘤相关蛋白的表达也可指导个体化治疗。研究[52]证明：CTCs中雄激素受体剪接变异体7(androgen receptor splice variant 7, AR-V7)蛋白表达水平检测有助于指导mCRPC患者的临床治疗，AR-V7蛋白阳性表达的mCRPC患者对雄激素受体信号(androgen receptor signal,ARS)抑制剂不敏感，而对紫杉类化疗药物较敏感，提示对CTCs中相关蛋白表达水平的分析可能是未来CTCs研究的方向之一。

4 展 望

近年来，CTCs在肿瘤早期筛查、诊治和监测等方面的研究已经取得显著进步，CTCs检测是目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段。CTCs检测安全无创并可反复获取以对肿瘤进行实时监测，作为液体活检的方式之一，CTCs检测有助于肿瘤个体化诊疗、转移监测和预后判断。临床实践中，充分利用患者血样中的CTCs可辅助制定最佳治疗计划，对其进行分子水平分析可实现对疾病的有效监测并发现新的治疗靶点。与传统影像学诊断、内镜检查和病理学诊断比较，CTCs检测的优势更显著，可更加敏感地发现疾病的变化，更科学和迅速地评价治疗方案的效果，但其作为新一代肿瘤标志物的探索和临床应用仍面临着诸多挑战，如CTCs的异质性和脆性、对CTCs基因表达认识的不足、相关检测技术价格高和存在假阳性及假阴性等。未来研究中，应改进分离和检测CTCs的方法以提高检测结果的特异度、敏感度及通量，优化培养及分析技术，更好地认识患者血样中CTCs的形态及功能特性。临床治疗中应实时监测CTCs计数以了解疾病进展，为患者制订更个体化的治疗方案以更好地辅助肿瘤精准治疗。