高通量测序技术在厌氧菌感染诊断中的作用

周 围，史伟峰，吴玉敏，王玉月

（苏州大学附属第三医院检验科，江苏 常州 213000）

感染性休克是患者多脏器感染导致器官功能受损的临床综合征，发病率和病死率较高[1]。采用下一代测序技术（next-generation sequencing，NGS）对感染样本进行高通量测序，可较为全面、客观地获得疑似致病微生物的属乃至种的信息，为危重感染患者提供快速、精准的诊断依据。有统计结果表明，从感染性休克的出现到抗菌药物使用的间隔时间越长，患者病死率越高[2]。因此，越快明确致病菌，越能显著提高重症感染患者的生存率。

厌氧菌感染是引起感染性休克的主要原因之一[1，3]，厌氧菌感染患者常出现发热症状，白细胞计数和中性粒细胞百分比增高，但常规细菌培养结果常常为阴性，给临床确诊感染病原菌带来困难。本研究通过分析2例诊断明确的感染性休克病例，探讨NGS在厌氧菌感染诊断中的价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集2018年3月苏州大学附属第三医院重症医学科收治的2例厌氧菌感染性休克患者临床资料。

1.1.1 病例1 男，49岁，因“右腰部肿痛伴发热4 d，意识淡漠0.5 d”入院。患者入院前1周因右腰部扭伤后进行针灸、推拿及药膏敷贴等治疗，3 d后出现腰部胀痛伴发热，体温最高38.4℃，于当地医院治疗（具体不详）后，症状加重转入苏州大学附属第三医院。体格检查：体温38.3℃，脉搏131次/min，呼吸41次/min，血压18.35/10.24 kPa（138/77 mmHg）（去甲肾上腺素持续泵入），神志淡漠，精神萎，反应迟钝，全身大汗，右侧颈部、腋下皮肤捻发感，右侧腰部红肿，压痛明显，局部皮温高。右肺呼吸音偏低，未及明显干、湿啰音，心脏、腹部无异常。实验室检查：白细胞计数9.10×109/L，中性粒细胞百分比86.4%，乳酸5.6 mmol/L。胸腹部电子计算机断层扫描：两侧慢性支气管炎、肺气肿改变伴右肺下叶感染（图1），两侧颈部、右侧胸部、右侧腰部、腋窝及背部多发皮下气肿，纵膈气肿。诊断为感染性休克、蜂窝组织炎。

1.1.2 病例2 男，85岁，因“右下肢疼痛超过10 d，加重伴胸闷1 d”入院。患者10 d前出现右下肢疼痛，不伴红肿和畏寒发热，至苏州大学附属第三医院风湿科就诊，予口服“美洛昔康”止痛无好转。于入院3 d前右下肢疼痛加剧，逐渐出现四肢浮肿，后胸闷气急加重，全身大汗，伴言语不清。体格检查：体温35.7℃，脉搏118次/min，呼吸40次/min，血压19.55/11.04 kPa（147/83 mmHg）。患者神志淡漠，精神萎，两侧肺未及明显干、湿啰音，心脏、腹部无异常，右下肢及右侧腹股沟肿胀，皮肤发紫。实验室检查：白细胞计数9.66×109/L，中性粒细胞百分比91.3%，乳酸12.5 mmol/L。胸腹部电子计算机断层扫描：两侧慢性支气管炎、肺气肿改变。肝脏多发低密度灶；右侧下肢软组织肿胀伴积气。诊断为感染性休克、肝脓肿、右下肢皮肤软组织感染。

1.2 细菌培养与鉴定

采集患者双侧静脉血，分别接种于血培养瓶（美国BD公司），接种量10 mL/瓶，置FX200血培养仪（美国BD公司）孵育。血培养瓶报阳后，分别转种至血平板、巧克力平板和麦康凯平板（法国科玛嘉公司），后于35℃ 5%CO2培养箱中培养24～48 h，待长出菌落后，采用PhoenixTM-100全自动细菌鉴定仪及配套鉴定卡（美国BD公司）、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）仪（德国Bruker公司）进行菌种鉴定。

将患者导管血、胸腔积液和伤口分泌物样本分别接种于血平板、巧克力平板和麦康凯平板，置于35℃、5%CO2培养箱中培养24～48 h，待长出菌落后，进行菌种鉴定。（1）PhoenixTM-100全自动细菌鉴定仪鉴定。用无菌棉签挑取菌落，将其浓度调制为0.5麦氏单位，按仪器标准操作规程进行细菌鉴定。（2）MALDI-TOF MS仪鉴定。用无菌棉签挑取菌落，点在靶板上，干燥后表面加1 μL α-氰基-4-羟基肉桂酸（美国Sigma Aldrich公司），室温干燥，进样至MALDI-TOF MS仪进行检测。参数设置：线性，正离子，蛋白峰谱质荷比范围为2000～20000，激光解析每孔100次。与Biotyper 3.0系统数据库进行比对，得出鉴定结果。（3）涂片直接鉴定。取100 μL全血、血培养菌液、伤口分泌物、脓液及胸腔积液，分别均匀涂布于干净的载玻片上，待干燥后进行革兰染色，镜检观察。

1.3 NGS测序

1.3.1 样本处理和DNA提取 收集患者300 μL血浆或2 mL胸腔积液、伤口分泌物，采用TIANamp Micro DNA试剂盒（北京天根生化科技有限公司），按照说明书要求提取基因组DNA。

1.3.2 文库构建和测序 采用Agilent 2100 Bioanalyzer（美国Agilent公司）质控文库插入片段大小，采用Qubit dsDNA HS Assay Kit（美国Thermo Fisher Scientific公司）质控DNA文库浓度，经环化形成单链环形结构。环化后的文库经滚环复制生成DNA纳米球。将制备好的DNA纳米球加载到测序芯片，送华大基因公司进行测序。

1.3.3 数据分析 去除低质量和长度＜35 bp的数据获得高质量的数据。通过比对BWA（http：//bio-bwa.sourceforge.net/）去除人基因组序列。余下数据去除低复杂度序列读数后与华大基因微生物大数据库进行比对，并将比对后的数据按照病毒、细菌、真菌和寄生虫等进行分类和排列。NGS对临床样本中微生物核酸的最低检出限为100～1000 拷贝/mL，一般5～10个序列数对应100 拷贝/mL[4]，核酸拷贝数也是判断样本中检出微生物是否为致病菌最重要的指标。

2 结果

2.1 病例1检测结果

采集病例13月7日入院时静脉血，直接涂片并革兰染色，找到阳性球菌，血培养5 d内均检出细菌生长；3月8日分别采集其穿刺液、胸腹水、伤口脓液直接涂片并革兰染色，找到阳性球菌和阴性杆菌；样本培养后经Phoenix-100全自动细菌鉴定仪和MALDI-TOF MS仪鉴定为星座链球菌，根据培养结果调整抗菌药物用药方案；3月11日采集患者全血、伤口分泌物和胸腔积液分别进行NGS测序，伤口分泌物样本中检出口普氏菌、坦纳拟普雷沃菌和沃氏嗜胆菌，检出序列数为分别为20610、5317和5016，胸腔积液样本中检出口普氏菌、坦纳拟普雷沃菌和星座链球菌，检出序列数分别为196696、95770和3357；全血样本中只检出坦纳拟普雷沃菌和伯克霍尔德菌，检出序列数分别为16和18。

2.2 病例2检测结果

采集病例23月26日入院时导管血，直接涂片染色，发现革兰阴性菌。导管血培养：需氧瓶、厌氧瓶分别于3 h和2 h检出细菌生长；3月26日采集患者静脉血行双侧双瓶血培养，导管侧血培养瓶检出细菌生长，无导管侧血培养瓶5 d内无细菌生长，血培养涂片和穿刺液直接涂片革兰染色发现阴性杆菌，经鉴定为大肠埃希菌；3月26日采集患者伤口分泌物和脓液，培养后分别检出星座链球菌和大肠埃希菌；3月27日，无菌采集患者全血和伤口分泌物行NGS测序，伤口分泌物样本中检出多形拟杆菌、不解糖卟啉单胞菌和星座链球菌，检出序列数分别为210616、156830和34637；血液样本中检出唾液乳酸杆菌和小韦荣球菌，检出序列数分别为401和18。

3 讨论

2例患者均为重症医学科感染性休克患者，入院期间在接受常规微生物培养及检测的同时，采用NGS进行感染性微生物检测，且最终根据NGS检测结果确诊为厌氧菌感染。NGS检测结果表明，病例1主要以口普氏菌和坦纳拟普雷沃菌等感染为主，这2种微生物为条件致病的革兰阴性专性厌氧菌[5]，推测与患者穿刺液和脓液首次涂片时发现的革兰阴性杆菌一致。比较患者各临床样本中高通量测序检出的微生物种类，发现患者的伤口分泌物与胸腔积液中的微生物种类及丰度极其相似，基本可以确定引起患者肺部感染的病原菌主要来源于其右腰部脓肿。病例2导管血培养和外周静脉血培养检出大肠埃希菌的药物敏感性试验结果完全一致，结合患者双侧双瓶血培养结果不一致的情况，推测患者血培养检出的大肠埃希菌可能为导管相关性感染[6]。患者全血NGS检测并未检出大肠埃希菌，也进一步验证了上述假设。

在基于培养方法的传统微生物检测过程中，没有发现这2例患者送检的临床样本中的大量专性厌氧菌，只检出样本中兼性厌氧的星座链球菌和大肠埃希菌，推测可能是在样本采集及运输过程中没有使用专用的厌氧容器，同时送检过程较长，导致送检的临床样本中的专性厌氧微生物活力降低甚至死亡，进而影响了后续厌氧菌培养的结果[7]。NGS在患者体内病原菌被清除后，仍能检出其残留的核酸[8]。NGS筛查病原菌不依赖分离培养，可直接对临床样本进行测序分析，相较于常规细菌鉴定过于依赖检验人员的经验来挑选待检菌落，NGS能够对样本进行无偏差的测序，从而得到临床样本中各种已知或未知病原体的相关信息。

NGS也有其局限性，如临床样本类型复杂，数据库的覆盖范围不够，导致NGS不能采取通用的样本处理和软件分析方法。同时，人员操作失误、仪器运行故障以及最终测序结果解读不当都可能导致诊疗决策失误。但随着测序成本的不断降低，可以对患者不同部位、不同时期的样本进行测序，从而有效规避由于仪器和人员失误造成的检测结果不准确。