两种实验室技术对肺结核患者手术后不同组织标本的检测结果分析

宫亚娅 鲁怀伟 王琦 操乐杰

结核病的准确诊断是有效治疗的关键因素，目前主要的诊断方法包括痰涂片抗酸染色、结核分枝杆菌培养及分子生物学检测等[1]。对于无痰患者，无法进行痰涂片抗酸染色和结核分枝杆菌培养。因此，可以考虑获取组织学证据排除其他诊断，最终确诊肺结核的存在。2010年12月，WHO的报告推荐使用GeneXpert MTB/RIF(简称“GeneXpert”)检测技术应用于肺结核的诊断[2]。中华人民共和国卫生行业标《WS 288—2017肺结核诊断》[3]也明确了病理学和分子生物学检查在肺结核诊断中的地位。本研究以安徽医科大学附属省立医院疑诊的肺结核患者为研究对象，评估抗酸染色和GeneXpert检测对肺结核手术标本的诊断价值。

资料和方法

一、研究对象

1. 研究对象的选择：收集2017年6月至2019年1月就诊于安徽医科大学附属省立医院，门诊诊断为疑诊肺结核，肺癌不能排除，行肺部手术治疗的63例患者。排除病理标本不合适的3例患者，最终纳入60例患者作为研究对象。其中，男42例，女18例；年龄21～80岁，平均年龄(48.0±13.4)岁。病理标本中，表现为干酪样坏死性肉芽肿的标本16例，表现为肉芽肿不伴有干酪样坏死的标本44例。

2. 纳入标准：(1)根据中华人民共和国卫生行业标准《WS 288—2017肺结核诊断》[3]，影像学(CT检查)提示结节病灶或空洞；考虑疑诊肺结核，肺癌不能排除。(2)因患者病灶位置及大小等原因，无法行支气管镜下穿刺或肺穿刺等活检-病理检查，因而行肺部手术获得病理组织，术后病理提示为肉芽肿性疾病，考虑为肺结核可能；依据《中国结核病病理学诊断专家共识》[4]，病理组织镜下表现具有渗出性、坏死性、增生性3种基本病理变化中至少一种病变类型。

3. 排除标准：临床资料不全，送检标本因过小、破碎、固定不当、自溶、严重变形等，无法做出诊断者。

二、研究方法

(一)仪器与试剂

光学显微镜(日本Olympus公司，型号CX31)、萋-尼(Ziehl-Neelsen，Z-N)染色液(珠海贝索生物技术有限公司)、GeneXpert检测系统和检测试剂盒[赛沛(上海)商贸有限公司]、晶芯®芯片分枝杆菌菌种鉴定试剂盒(DNA微阵列芯片法；博奥晶典生物技术有限公司)。

(二)检测方法

1. 抗酸染色法：将肺手术标本置于10%中性福尔马林溶液中充分固定，常规石蜡包埋切片，切片厚度为3～4 μm，65 ℃烤片2 h，脱蜡2次，每次5～10 min，切片脱蜡后，待余液挥发干，用流水冲洗至无肉眼可见油状物附着，使用Z-N方法染色。常规脱水和安装后，由2位病理学家在油镜下检查处理过的样本。具体操作参见《结核病诊断实验室检验规程》[5]。

2. GeneXpert检测：在一支干净的离心管中加入8片10 μm厚手术肺组织石蜡包埋切片，加入320 μl脱蜡溶液，于56 ℃孵育3 min，加入180 μl ATL缓冲液，旋涡振荡，11 000×g离心1 min，加入20 μl蛋白酶K至下部澄清的液相层中，于56 ℃孵育至少1 h直至组织切片完全消化，再于90 ℃孵育1 h。将下部无色透明的液相及底部沉淀一同吸出至一个新的螺盖离心管中(>2 ml)，向其中加入2 ml样本处理液，涡旋振荡混匀后，加入试剂匣。GeneXpert检测结果在2 h内自动生成并报告为未检测到MTB或检测到MTB，半定量化为极少量、少量、中量、大量；同时报告利福平敏感或耐药。实验操作严格按照GeneXpert检测试剂盒说明书使用。

3. 分枝杆菌菌种鉴定：采用晶芯®芯片分枝杆菌菌种鉴定试剂盒(DNA微阵列芯片法)进行分枝杆菌菌种鉴定。将手术肺组织石蜡包埋切片标本置于无菌密封瓶，将标本分为2份，1份用于检测，另1份用于两种检测有差异时的复查备用或进行重复性实验；向灭活后的标本中加入等体积10%的NaOH溶液，于37 ℃液化30 min；取1 ml上述液化标本，以离心半径8 cm，12 000 r/min离心5 min，去除上清液；向离心管中加入1 ml生理盐水，涡旋后再次以离心半径8 cm，12 000 r/min 离心5 min，去上清液备用。将上清液进行核酸提取、PCR扩增，将杂交溶液加入芯片，置于杂交仪，50 ℃杂交2 h后于杂交仪中洗涤，将完成洗涤、甩干的芯片插入LuxScanTM10K-B微阵列芯片扫描仪插槽中，运行相应的分枝杆菌菌种鉴定程序，对芯片进行扫描及判读。实验操作严格按照分枝杆菌菌种鉴定试剂盒说明书使用。

三、统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计数资料以“率(%)”表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

60例疑诊肺结核患者的手术病理标本中，抗酸染色检出阳性29例，GeneXpert检出阳性28例。抗酸染色、GeneXpert的阳性检出率分别为48.3%(29/60)和46.7%(28/60)。其中，4例GeneXpert检测阳性，抗酸染色结果为阴性；5例GeneXpert检测阴性，抗酸染色结果为阳性。若以任意一种方法检测阳性作为联合检测的阳性标准，联合检测的阳性率为55.0%(33/60)，较抗酸染色的阳性检出率提高 6.7%，较GeneXpert的阳性检出率提高8.3%。

在60例疑诊肺结核患者中，GeneXpert检测在干酪样和非干酪样坏死标本中的阳性检出率分别为81.2%(13/16)和34.1%(15/44)；抗酸染色在干酪样和非干酪样坏死标本中的阳性检出率分别为87.5%(14/16)和34.1%(15/44)。GeneXpert检测和抗酸染色检测干酪样坏死标本的检出率均明显高于非干酪样坏死标本，差异均有统计学意义(χ2=10.48，P=0.001；χ2=13.40，P<0.001)。

60例标本中，5例标本抗酸染色阳性，GeneXpert检测为阴性；为排除非结核分枝杆菌感染的可能，此5例标本进行分枝杆菌菌种鉴定，结果显示5例均为结核分枝杆菌，提示GeneXpert检测存在假阴性的可能。在GeneXpert检测阳性的28例标本中，有3例(10.7%)被报告为对利福平耐药。

讨 论

由于结核分枝杆菌病原菌的基因变异，糖皮质激素、免疫抑制剂的广泛应用，抗生素的不规范使用等原因，越来越多肺结核患者的症状、体征变得不典型，当影像学表现为结节或肿块时，容易与肺癌或结节病相混淆[6]。病理检查为诊断结核病的方法之一，不同结核病患者的病理标本可以见到渗出、增生、变性坏死等不同类型的结核病病理表现，不同病理类型反映了患者机体的不同免疫状态[7]。同时，能引起与结核病相似的肉芽肿性炎和坏死的病因很多，包括非结核分枝杆菌感染、曲霉菌病、隐球菌病、异物肉芽肿等，需要与结核病鉴别[8]。由于抗酸染色易受非结核分枝杆菌的干扰，因此不能仅凭抗酸染色阳性就确诊结核病，而只能提示可能存在结核病[5]。而新近发展的分子检测方法针对结核分枝杆菌核酸进行检测，可以对结核病患者进行明确诊断。

GeneXpert检测为一种全自动实时聚合酶链反应测定法，由工作人员进行较少的培训即可完成，可以在2 h内提供结果，同时具有操作简便、核酸污染低、操作人员安全等优点[9]。对肺结核的诊断有很高的特异度，并且已广泛应用于结核病的诊断[10-11]。Rindi等[12]评估了石蜡包埋的组织标本行GeneXpert检测的可行性，研究共收集了14份标本，3份来自胸膜，1份来自锁骨上淋巴结，10份来自肺组织，在所有14份抗酸染色阳性标本中GeneXpert检测结果均为阳性。但本研究有5份标本抗酸染色结果为阳性，GeneXpert检测为阴性，且随后进行的分枝杆菌菌种鉴定结果均为结核分枝杆菌，原因可能在于石蜡组织经固定、脱水、透明等前期处理时，对结核分枝杆菌DNA产生了影响，特别是对于含菌量极少的组织，长期储存可能导致DNA降解(本研究收集的标本时间为2年内)，使其GeneXpert检测结果显示为阴性[13]。此外，当患者肺组织标本中含菌量极少时，抗酸染色切片和GeneXpert检测切片不在同一切面上，有可能存在GeneXpert切片组织内不含菌的情况。因此，获得合适的肺组织病理切片，并立即进行检测可提高GeneXpert的阳性检出率。抗酸染色因具备简便、花费少的特点，可在患者初筛时使用，但是由于其无法鉴别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，仅能做出提示性诊断，无法最终确诊，为获得明确诊断结果，仍需依赖GeneXpert检测，必要时可采取两种方法联合检测。本研究结果显示，GeneXpert与抗酸染色方法联合检测的阳性检出率为55.0%，达到“十三五”全国结核病防治规划要求的到2020年病原学检出率提高至50%的目标。

本研究结果显示，4例患者GeneXpert检测结果为阳性，抗酸染色未能检出，提示如果患者临床表现符合肺结核特征，抗酸染色阴性不能完全排除结核病。同时，GeneXpert检测可以利用实时荧光定量核酸检测技术，在检测结核分枝杆菌的同时检测是否对利福平耐药，且GeneXpert检测与药物敏感性试验在检测利福平耐药性上具有高度一致性，可为后续治疗提供依据[14]。本研究中，检测出利福平耐药的比率为10.7%，说明在明确诊断肺结核的患者中存在一定比例的耐利福平患者，如果能够同时将耐药结果检测出来，对于规范结核病的诊断、及时合理治疗耐药结核病具有重要意义。

本研究存在很多不足之处：首先，研究样本量偏小；其次，本研究仅对抗酸染色阳性、GeneXpert检测阴性的标本进行了菌种鉴定，未对全部患者标本进行菌种鉴定；再者，本研究未纳入非结核病患者，无法进行特异度及其他检测效能的比较。未来还需要收集更多的病理标本进行相关的验证。