慢病毒介导的性别决定区Y 框蛋白9 表达下调对抑制Wnt 信号通路调控乳腺癌细胞侵袭能力的影响

2020-02-10马耀增张茂锋刘洪波王鹏王宏伟

安徽医药 2020年2期

马耀增，张茂锋，刘洪波，王鹏，王宏伟

作者单位：洛阳市第一人民医院普外二科，河南洛阳 471002

乳腺癌多发于女性，极少数的男性也有发生，其是起源于乳腺上皮组织的恶性肿瘤，原发性的乳腺癌致死率不高，乳腺癌转移是其致死的重要原因，乳腺癌转移机制较为复杂，乳腺癌细胞从原发部位脱落以后，进入淋巴管或血管到达新的组织器官形成转移灶，这一过程中乳腺癌细胞侵袭、迁移、上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是关键［1-2］。Wnt 信号通路在肿瘤中过度激活，抑制其激活后可以降低肿瘤细胞的转移和增殖能力［3］。性别决定区Y 框蛋白9（sex dtermining region Y-box 9，SOX9）是一种癌基因，在乳腺癌等多种肿瘤中高表达，沉默其表达可以抑制肿瘤细胞的转移能力［4-5］。有研究显示，SOX9 位于Wnt 信号通路的下游，Wnt 信号通路激活后可以上调SOX9 的表达，发挥促肿瘤作用［6］。目前对于SOX9在乳腺癌细胞侵袭、迁移中的作用尚不明确，本实验自2017年3月至2018年3月以乳腺癌细胞MDA-MB-436为体外研究对象，探讨SOX9 对乳腺癌细胞侵袭迁移能力的影响及Wnt 信号通路的调控作用，以期为明确乳腺癌转移机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料乳腺癌细胞MDA-MB-436 购自上海酶研生物科技有限公司；Wnt信号通路抑制剂XAV939购自美国MedChemExpress；SOX9抗体、β-连环蛋白（β-catenin）抗体、c-myc抗体购自Santa Cruz Biotechnology；基质金属蛋白酶-2（matrix metalloprotease，MMP-2）抗体、上皮性钙黏附素（E-cadherin）抗体、神经性钙黏附素（N-cadherin）抗体购自美国Cell signaling Technology；SOX9 siRNA 慢病毒由上海锐赛生物技术有限公司构建包装；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

MDA-MB-436 细胞培养条件为：37 ℃，5%二氧化碳培养箱，饱和湿度。细胞密度为90%时，添加0.25%的胰蛋白酶将细胞消化后，接种在细胞培养瓶中继续培养。

1.2 Wnt 信号通路抑制剂对乳腺癌细胞增殖活性影响 MDA-MB-436 细胞浓度调整为每100 μL 的细胞悬浮液中含有3 000个细胞，种植到96孔板中，每个孔内加入100 μL，孵育过夜以后，把上清液吸除，添加含有0、5、10、20、40 μmol/L的Wnt信号通路抑制剂XAV939 的细胞培养液，继续培养24 h。在实验孔中加入20 μL的噻唑蓝（MTT）结合4 h以后，将MTT 溶液吸除，加入二甲基亚砜（DMSO）将结晶溶解以后，选取570 nm，用酶标仪检测OD 值。以0 μmol/L 作为对照，以不加细胞的孔作为空白孔，分析细胞抑制率，设置0 μmol/L作用组抑制率为0，分析其他浓度梯度抑制率变化。

1.3 抑制Wnt信号通路对乳腺癌细胞中SOX9、βcatenin、c-myc 蛋白表达影响MDA-MB-436 细胞用0、20 μmol/L的XAV939处理24 h以后，按照每个6 孔板中加入120 μL 的蛋白裂解液将细胞裂解以后，以14 000g离心约5 min后，吸取上清，把沉淀弃掉。取10 μL的蛋白用于二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量检测，其余样品中加入5×上样缓冲溶液，置于水浴中煮沸5 min。分别配制9%的分离胶及5%的浓缩胶，把预先准备好的蛋白加入到聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上样孔内，每个孔中加入20 μg蛋白，常规方法电泳以后，进行转膜。PVDF膜靠近正极，凝胶靠近负极，0.25 A电流进行转膜约180 min。以TBST（Tris-HCl 缓冲盐溶液+Tween）洗涤以后，把聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜放在含有封闭液（5%牛血清白蛋白）的平皿中孵育2 h，再与SOX9、β-catenin、c-myc 抗体在4 ℃过夜孵育后，再放在二抗反应液中孵育2 h。ECL 发光，显影后，分析条带的光密度值，以每组的GAPDH 作为参照。SOX9、β-catenin、c-myc抗体以1∶200、1∶400、1∶400稀释，二抗以1∶5 000稀释。

1.4 实验分组和慢病毒感染MDA-MB-436 细胞分成4组，依次为对照组、XAV939、SOX9-si、SOX9-si＋XAV939，对照组、XAV939 用感染阴性对照慢病毒的MDA-MB-436 细胞，SOX9-si、SOX9-si＋XAV939用感染SOX9 siRNA 慢病毒的MDA-MB-436 细胞。XAV939、SOX9-si＋XAV939 在实验开始0 h 时在细胞培养液中添加20 μmol/L 的XAV939。MDA-MB-436 细胞慢病毒感染步骤简述如下：细胞密度为40%时，在细胞中加入慢病毒颗粒，调整慢病毒感染复数为20，感染12 h后，把细胞培养板取出，添加新鲜的培养液，培养3 d以后，用puromycin筛选稳定感染的细胞株扩大培养。

1.5 干扰效果检测用Realtime PCR 和蛋白质印迹法检测干扰效果，蛋白质印迹法步骤同上。Realtime PCR 步骤如下：将对照组、SOX9-si 细胞用冰预冷的PBS 洗涤后，按照每个6 孔板中加入1mL 的TRIZOL 裂解液把细胞裂解以后，添加1/5体积的氯仿溶液混合离心后，吸取水相层的溶液，加入异丙醇后在室温沉淀RNA，离心后，用75%的乙醇将RNA 洗涤，晾干后，添加无RNase 水溶解以后，进行cDNA 合成。用M-MLV 和oligo（dT）合成cDNA，步骤同试剂盒说明书。取cDNA，进行Realtime PCR，0.5 μmol/L 的正、反向引物各1 μL、12.5 μL的SYBR Premix TaqTM、1 μL 的cDNA 模板、25 μL 的ddH2O混合后，置于PCR 仪上，程序设置为：95 ℃预变性30 s 后，进行PCR 反应，PCR 共循环40 次，程序为95 ℃5 s，60 ℃20 s。GAPDH正向引物为5’-AATCCATCACCATCTTCCA-3’，反向引物5’-TGGACTCCACGACGTACTCA-3’。SOX9 正向引物为5’-CATCACCCAGGTCAGCAA-3’，反向引物5’-TGGAGGTTTATAGCTCGG-3’。

1.6 细胞迁移能力检测细胞划痕实验检测细胞迁移能力。取慢病毒感染后的乳腺癌细胞接种到6孔板，接种密度为5×105个/孔，细胞铺满以后，枪头垂直的在底部划出细痕，添加PBS 将划落的细胞洗涤，用不含血清的细胞培养液培养，按照对照组、XAV939、SOX9-si、SOX9-si＋XAV939 分组处理，在0 h 和24 h 检测划痕宽度。细胞迁移率为细胞迁移的距离与划痕初始宽度的百分比。

1.7 细胞侵袭能力检测用Transwell 小室检测细胞侵袭能力变化。取8 μm 的Transwell 小室，添加DMEM稀释的Matrigel，放置于37 ℃孵育1 h。将对照组、XAV939、SOX9-si、SOX9-si＋XAV939 按照上述方法处理，悬浮于不含血清的培养液中，细胞密度为5×105个/mL，每个小室中加入200 μL的细胞悬浮液，侵袭时间设置为24 h。将培养板取出以后，用4%的多聚甲醛固定，苏木素染色以后，在光学显微镜下观察细胞数目，每组至少选取10个视野。

1.8 细胞中MMP-2和EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin 表达水平检测将对照组、XAV939、SOX9-si、SOX9-si＋XAV939 按照上述方法处理，培养24 h以后，用蛋白质印迹法方法测定细胞内MMP-2、E-cadherin、N-cadherin蛋白水平变化，步骤同上。

1.9 统计学方法实验数据用SPSS 21.0 软件分析，采用±s表示，两组数据用独立样本t检验；多组差异比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Wnt 信号通路抑制剂XAV939 对乳腺癌细胞增殖影响乳腺癌细胞经过5、10、20、40 μmol/L 的XAV939 处理以后，乳腺癌细胞抑制率依次升高，XAV939 能够下调乳腺癌细胞的增殖活性。20 μmol/L 的XAV939 处理后细胞抑制率接近50%，选用20 μmol/L的XAV939作后续研究。见表1。

表1 不同浓度的XAV939对乳腺癌细胞增殖影响/（%，）

2.2 Wnt 信号通路抑制剂对乳腺癌细胞中SOX9表达影响乳腺癌细胞经过20 μmol/L 的XAV939处理后，细胞中的SOX9蛋白水平降低，同时细胞中Wnt信号通路关键因子β-catenin、c-myc蛋白水平也降低。XAV939 具有下调乳腺癌细胞中SOX9 表达水平的作用。见图1，表2。

图1 蛋白质印迹法测定XAV939处理后细胞中SOX9蛋白及β-catenin、c-myc蛋白水平

表2 XAV939处理后细胞中SOX9蛋白及β-catenin、c-myc蛋白水平变化/

2.3 慢病毒感染后对乳腺癌细胞中SOX9 表达影响乳腺癌细胞感染SOX9 siRNA 慢病毒后，细胞中的SOX9蛋白水平和mRNA 水平均降低。构建了下调SOX9的乳腺癌细胞株。见图2，表3。

图2 蛋白质印迹法测定慢病毒感染后细胞中SOX9蛋白水平

表3 慢病毒感染后细胞中SOX9蛋白和mRNA水平/

2.4 下调SOX9 对XAV939 处理后的乳腺癌细胞侵袭和迁移能力影响XAV939处理后的乳腺癌细胞侵袭数目和迁移率均明显降低，下调SOX9 后的乳腺癌细胞的侵袭数目和迁移率也降低。XAV939处理下调SOX9 后的乳腺癌细胞，细胞的侵袭数目和迁移率降低更多。下调SOX9 协同XAV939 抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移。见表4。

表4 下调SOX9和XAV939后细胞侵袭和迁移能力变化/

注：与对照组比较，aP＜0.05；与SOX9-si、XAV939比较，bP＜0.05

2.5 下调SOX9对XAV939处理后的乳腺癌细胞细胞中MMP-2、E-cadherin、N-cadherin 表达影响XAV939处理后的乳腺癌细胞中MMP-2表达水平降低，E-cadherin 表达水平升高，N-cadherin 表达水平降低。下调SOX9后的乳腺癌细胞中MMP-2、N-cadherin水平也降低，E-cadherin水平升高。XAV939处理下调SOX9 后的乳腺癌细胞，细胞中MMP-2 蛋白水平降低更多，E-cadherin 蛋白水平升高更多，Ncadherin 蛋白水平也下降更多。下调SOX9 协同XAV939 抑制乳腺癌细胞EMT 和合成基质降解酶MMP-2。见图3，表5。

3 讨论

SOX9 是目前为止研究最为广泛的SOX 蛋白家族成员之一，其在人类早期的胚胎发育中具有重要作用，其突变、重复后可以引起性别反转、CD 综合征，后续的研究表明，SOX9 在心脏、骨骼肌等的发育中也具有调控作用，其表达水平异常参与肿瘤的发生，在乳腺癌、骨肉瘤、卵巢癌、前列腺癌等肿瘤组织中均发现SOX9 高表达，并且其参与肿瘤细胞的分化、生长、侵袭等过程［7-12］。本研究表明，下调SOX9 后的乳腺癌细胞的侵袭迁移能力降低，提示SOX9在乳腺癌转移中可能发挥促进作用。

图3 蛋白质印迹法检测下调SOX9及XAV939对细胞中MMP-2、Ecadherin、N-cadherin蛋白表达影响

表5 下调SOX9和XAV939处理后细胞中MMP-2、E-cadherin、N-cadherin蛋白水平变化/

Wnt 信号通路参与癌症的发生过程，其在肿瘤组织中过度激活，对于肿瘤细胞的生长、侵袭等生物学特性均有调控作用［13-14］。Wnt信号通路是一个进化极为保守的、与胚胎发育有关的信号通路，调控着细胞的极化、增殖等多种生物学过程，β-catenin是经典Wnt 信号通路的关键因子，其在没有Wnt 信号时与细胞质内的蛋白质磷酸酶等形成复合物，该复合物被磷酸化后可以被蛋白酶直接降解，在受到Wnt 信号刺激以后，β-catenin 形成的复合物不能被磷酸化导致β-catenin降解受阻，引起β-catenin在细胞质内积累，细胞质内过量的β-catenin可以进入细胞核，引起下游靶基因的表达，从而发挥调控细胞多种生物学特性的作用［15-20］。本实验表明，Wnt 信号通路抑制剂可以降低乳腺癌细胞的增殖活性，下调乳腺癌细胞的侵袭和迁移能力，提示Wnt 信号通路抑制剂XAV939具有抗肿瘤作用。

目前关于Wnt 信号通路与SOX9 的调控作用研究尚不明确，在皮肤鳞癌中的研究表明，下调βcatenin表达后的皮肤鳞癌细胞中SOX9表达水平降低，细胞的增殖能力下降，并且过表达SOX9可以部分恢复下调β-catenin对细胞增殖的影响，在软骨细胞中的研究也证实，β-catenin 可以通过调控SOX9的表达影响关节软骨修复能力，在结肠癌中的研究表明，灭活APC 可以激活小鼠中Wnt 信号通路，诱导SOX9的表达，促进结肠腺瘤性上皮细胞的增殖，以上这些研究结果表明，SOX9可能受到Wnt信号通路的正调控作用［21-25］。本实验的结果显示，Wnt 信号通路抑制剂可以下调乳腺癌细胞中SOX9 的表达，并且下调SOX9 表达后的乳腺癌细胞经Wnt 信号通路作用后，细胞的侵袭和迁移能力降低更多，这可能提示Wnt 信号通路可以通过调控SOX9的表达影响乳腺癌细胞的侵袭和迁移。

综上，下调SOX9可以降低乳腺癌细胞侵袭、迁移及EMT 能力，SOX9 参与介导Wnt 信号通路调控乳腺癌细胞侵袭迁移过程，Wnt 信号通路能够正调控乳腺癌细胞中SOX9 的表达，这为以后研究乳腺癌发病机制及Wnt信号通路、SOX9之间的具体调控位点奠定了基础。本实验没有研究上调SOX9对抑制Wnt 信号通路的逆转作用，没有在多株细胞中进行验证，在后续实验中会对上述部分进行深入探讨。