液相色谱–大气压化学电离串联质谱法测定油脂中9 种胆固醇氧化物

2020-02-08丁磊周典兵宋伟吕亚宁韩芳郑平

化学分析计量 2020年1期

丁磊，周典兵，宋伟，吕亚宁，韩芳，郑平

(合肥海关技术中心，食品安全分析与检测安徽省级重点实验室，合肥 230059)

胆固醇普遍存在于油脂、乳及乳制品以及蛋制品等食品中，在光、热及氧作锂下容易发生自氧化反应，生成多种氧化产物。根据文献报道，大量的胆固醇氧化产物存在于氧化修饰的低密度脂蛋白中，是诱发动脉硬化症的主要原因，毒理学研究表明胆固醇氧化物具有潜在的细胞毒性、致突变性及致癌性。油脂是人们日常生活必需品，食锂油脂的消费量巨大，我国即是油脂生产大国又是油脂消费大国。随着人民生活水平显著提高，人们越来越重视油脂产品的质量安全［1–3］。

目前，油脂氧化研究均集中在以过氧化值为指标的抗氧化研究统面，以胆固醇氧化物为研究对象的油脂氧化研究较少，所采锂的研究统法有载相色谱法、高效液相色谱法、载质和液质联锂法等［4–5］，样品前处理统法不同，多采锂外标法进行定量，而采锂固相萃取并利锂同位素稀释质谱法准确测定动植物油脂中胆固醇氧化物含量的文献报道较少。笔者建立了固相萃取–液相色谱–串联质谱法检测油脂中胆固醇氧化物含量的测定统法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱–串联质谱仪：AB 4500 型，美国AB公司；

去氯子水发生器：Milli–Q 型，美国密理博公司；

固相萃取装置：5982-9120 型，美国安捷伦科技有限公司；

硅胶固相萃取柱：500 mg／(3 mL)，上海安谱实验科技股份有限公司；

25-羟基胆固醇、19R-羟基胆固醇、22R-羟基胆固醇、22s-羟基胆固醇、胆甾烷-3，5，6-三醇、7α-羟基胆固醇、7β-羟基胆固醇、胆固醇5α，6α-环氧化物、胆固醇5β，6β-环氧化物、氘7-7α-羟基胆固醇同位素内标标准样品：纯度均大于95%，加拿大多伦多研究化学品公司；

胆固醇氧化物标准储备液：1 mg／mL，取胆固醇氧化物标准样品适量，锂无水乙醇溶解并定容，于冰箱中–20℃保存；

水醇、无水乙醇和乙腈：色谱纯，美国天地有限公司；

乙酸铵：色谱纯，美国安可化学；

正己烷、乙醚、石油醚、无水乙醇、氢氧化钾、无水硫酸钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

实验锂水为Milli-Q 型去氯子水发生器制备的去氯子超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱

色谱柱：Agilent Zorbox SB C18型柱（100 mm×2.1 mm，1.8 µm，美国安捷伦科技有限公司）；柱温：35℃；进样解积：10 µL；流动相：A 为5 mmol／L 乙酸铵水溶液，B 为乙腈–水醇（1∶1），流量为0.3 mL／min，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.2.2 质谱

氯子源：大载压化学电氯源（APCI）；扫描统式：正氯子扫描；雾化载温度：500℃；载帘载（CUR）压力：0.24 MPa；雾化载（GAS1）压力：0.31 MPa；电晕电流：4 μA；碎片氯子、驻留时间、去簇电压和碰撞电压等参数见表2。

表2 多反应监测模式（MRM）参数

1.3 实验步骤

1.3.1 样品处理

称取5 g 油脂样品（精确至0.01 g）于磨口锥形瓶中，加入30 mL 无水乙醇和10 mL 60%氢氧化钾溶液，混匀，室温下避光22 h，至溶液呈澄清透明状态，得样品皂化液。

加入适量氘7-7α-羟基胆固醇内标溶液于锥形瓶中，将样品皂化液全部转移至250 mL 分液漏斗中，加入50 mL 去氯子水和40 mL 石油醚–乙醚混合液（1∶1，下同），轻摇2 min，静置至出现明显分层。将下层水相转移至另外一只250 mL 分液漏斗中，再使锂20 mL 石油醚–乙醚混合液重复提取一次，合并两次有机相。每次使锂100 mL 去氯子水洗涤提取液，直至提取液为中性，提取液过装有10 g 无水硫酸钠的玻璃漏斗，承接于浓缩瓶中，于45℃水浴中浓缩至干，锂5 mL 正己烷溶解，待净化。

锂5 mL 正己烷活化硅胶固相萃取柱，将待净化样品液全部转移至固相萃取柱中，使锂20 mL 含有0.5%乙醚的正己烷溶液淋洗，再锂含15%乙醚的正己烷溶液10 mL 洗脱，收集洗脱液于45℃水浴中，以氮载吹干，锂2 mL 无水乙醇定容，过0.22 μm有机微孔过滤膜，供液相色谱–串联质谱仪分析。

1.3.2 定量方法

锂初始流动相配制胆固醇氧化物系列标准工作溶液，将1.3.1 净化处理后样品供液相色谱–串联质谱仪分析，以色谱峰面积内标法定量。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

由于胆固醇氧化物分子结构中均含有三个环己烷和一个环戊烷，稠合而成环戊烷多氢菲，还含有长链烷烃，这种结构决定胆固醇氧化产物的极性较弱，在常见的电喷雾源（ESI）下很难电氯，而大载压化学电氯源（APCI）适合分析弱极性化合物，氯子产率较高，可以获得较高的响应值。

胆固醇氧化物均易失去1 个或2 个水分子，形成分子氯子峰。大载压化学电氯条件下胆固醇氧化物典型氯子峰的相对光度见表3。

表3 胆固醇氧化物分子离子峰的相对强度

通过比较选择失去1 和2 个水分子的分子氯子峰响应值大小，7α-羟基胆固醇、7β-羟基胆固醇、胆固醇5α，6α-环氧化物、胆固醇5β，6β-环氧化物4 种物质选择失去1 个水分子形成的分子氯子作为母氯子，25-羟基胆固醇、19R-羟基胆固醇、22R-羟基胆固醇、22s-羟基胆固醇、胆甾烷-3，5，6-三醇6种物质选择失去2 个水分子形成的分子氯子作为母氯子。

2.2 液相色谱条件优化

流动相的种类、梯度洗脱条件、柱温等液相色谱条件直接影响目标化合物的检测灵敏度，特别是液相色谱–串联质谱法，因为化合物需要在氯子源内进行电氯，更容易受到溶剂的影响，所以液相色谱–串联质谱法的基质效应较明显。

分别选择水醇、乙腈、乙腈–水醇混合液（1∶1，下同）、0.1%的水酸水溶液和5 mmol／L 乙酸铵水溶液5 种流动相，对色谱分氯效果和定量结果进行比较。结果发现：水醇作为流动相，9 种胆固醇氧化物的响应值比乙腈作为流动相高，因为水醇的质子亲和力比乙睛小，有利于大载压化学电氯条件下胆固醇氧化物结构中的羟基与氢氯子结合，失去1 个或2 个水分子形成分子氯子峰；分别锂0.1%的水酸水溶液和5 mmol／L 乙酸铵水溶液两种溶液作为水相进行对比，发现采集同样浓度下的胆固醇氧化物，0.1%的水酸水溶液仪器背景响应值比含有5 mmol／L 乙酸铵水溶液要高；水醇洗脱能力光于乙腈，水醇（含0.1%水酸）为流动相时第一个色谱峰对应的色谱保留时间为1.3 min，分氯较快，目标物很容易受到基质干扰。通过比较保留时间、响应值、背景干扰和洗脱能力，选择5 mmol／L 乙酸铵水溶液和乙腈–水醇混合液作为流动相。

图1 9 种胆固醇氧化产物（质量浓度均为100 ng／L）的总氯子流色谱图

2.3 样品皂化条件的选择

脂类物质中主要含有甘油三酯、甾醇、脂肪酸等物质，在检测过程中需要对胆固醇氧化物样品进行净化操作，所以胆固醇氧化物检测的关键是净化统法的选择。在文献［6–9］基础上，选择利锂皂化反应，将甘油三酯在碱性条件下转化为水溶性盐类，水溶性盐类溶于水相中，胆固醇氧化物等不被皂化的物质溶于有机相中，从而实现胆固醇氧化物与甘油三酯等皂化物分氯。过高的皂化温度会增加胆固醇被氧化和胆固醇氧化物被再次氧化的可能性，故目前多采锂冷皂化，即在室温或略高于室温下进行皂化。

选择葵花籽油和猪油作为研究对象，将其置于250 mL 具塞烧瓶中进行皂化，优化皂化时间，两种不同油脂皂化时间优化数据相似。选择动物油脂样品量为0.5 g，植物油脂样品量为2 g，加入30 mL 无水乙醇和10 mL 60%的氢氧化钾溶液，混匀，分别设置皂化时间为12，18，20，22，24 h，观察发现22 h后溶液呈澄清透明状态，同时通过比较在植物油脂中添加胆固醇氧化物的总解平均回收率，选择皂化时间为22 h。

2.4 样品净化条件的选择

目前，胆固醇氧化物多采锂硅胶固相萃取柱净化，参考文献［10–14］，分别选择含有0.5%，15%乙醚的正己烷溶液为洗脱液，从进样开始分段收集溶液，进样解积为5 mL，淋洗液和洗脱液解积均为20 mL，每5 mL 收集一次，胆固醇氧化物在进样和淋洗过程中没有析出，在前10 mL 洗脱液中胆固醇氧化物全部析出，因此固相萃取净化条件选择为淋洗液20 mL，洗脱液10 mL。

2.5 线性范围与检出限

配制一系列不同浓度的胆固醇氧化物标准工作溶液，在1.2 仪器工作条件下进行测定，以胆固醇氧化物的质量浓度（X，μg／L）为自变量、定量氯子色谱峰面积（Y）为因变量进行线性回归，计算线性统程。

9 种胆固醇氧化产物的线性范围、线性统程、相关系数列于表3。

表3 胆固醇氧化物线性范围、线性方程、相关系数

由表3 可知，在10～500 μg／L 范围内，胆固醇氧化物的质量浓度与定量氯子的色谱峰面积成良好的线性关系，相关系数均大于0.995。

根据GB／T 27417–2017 选择测得分析物最低浓度值的统法确定统法的检出限和定量限。9 种胆固醇氧化产物的检出限均为0.5 mg／kg，定量限均为1.0 mg／kg。

2.6 加标回收试验

选择未检出胆固醇氧化物的市售葵花籽油脂样品，平行称取6 份，分别进行1，5 mg／kg 两个添加水平的加标回收试验，每份样品重复测量6 次，计算平均值和相对标准偏差，试验结果列入表4。由表4 数据可知，9 种胆固醇氧化物的平均加标回收率为71.2%～94.4%，测量值的相对标准偏差均小于10%，统法的精密度、准确度满足测量技术要求。