利用CRISPR与小分子联合实现剂量依赖性激活靶基因的表达（2020.1.11 Plant Biotechnology Journal）

利用CRISPR - Cas9系统可以激活或抑制基因的表达。然而，在不使用外源性转录调控蛋白的情况下，目前仍然缺少能够实现剂量依赖性激活基因表达的工具。

美国北卡罗来纳大学教堂山分校Nathaniel A. Hathaway、西奈山伊坎医学院Jian Jin等研究人员合作于2019年11月11日在Nature Biotechnology上发表了题为“Dose-dependent activation of gene expression is achieved using CRISPR and small molecules that recruit endogenous chromatin machinery”的有关CRISPR除基因编辑外其他生物学作用的相关论文。该研究发现利用CRISPR和小分子，通过招募内源性染色质机器可以实现剂量依赖性激活基因表达。

该报道，描述了化学表观遗传修饰器（CEMs），它通过招募内源性染色质激活机制的相关成分来激活目标基因的表达，从而消除了对外源性转录激活蛋白的依赖。该系统由两部分组成：含FK506结合蛋白（FKBP）的复合物中的催化失活的Cas9 （dCas9）以及一个含有FK506并连接一个能够与细胞表观机器相互作用的CEM。研究发现，CEMs上调目标内源性基因表达多达20倍或更多（这主要取决于目标基因）。该研究还证明了转录激活的剂量依赖性调控，跨越多个不同基因的功能，CEM活性的可逆性以及整个基因组中同类最佳CEM的特异性。

作者首先介绍了CEMs，及其家族主要成员，以及说明了CEMs是如何调控靶基因的表达的（如图1）。研究指出，该论文中CEM家族主要包括CEM87、CEM88和CEM114这三个成员，他们结合在染色体的不同区域。研究指出，CEMa家族与基于dcas9 - fkbp的系统兼容，允许我们将CEMa活性导向任何基因。

此外，该项研究还根据时间和剂量范围对dCas9 - cema系统进行评估，并根据当前的dCas9激活技术对系统进行基准测试（如图2）。为了靶向内源基因，调整了优化的dCas9–CEMa系统，以通过慢病毒感染dCas9机器（dCas9和MS2-FKBP）将其导入HEK293T细胞。为了确定观察激活的最佳时间，研究者用gRNA转染了表达dCas9和MS2-FKBP×2的细胞，并在处理后24、48、72、96和120 h进行了RNA提取。 在处理后48小时，带有MYOD1靶向gRNA的细胞在200 nM CEM87中表达显着增加。同时发现靶向gRNA的细胞在50 - 400nm剂量范围内48h后，MYOD1呈剂量依赖性激活。然而，与未处理的细胞相比，NT gRNA的细胞在400 nM剂量处理48小时后，MYOD1的非特异性激活较低。

该研究还做了dCas9–CEMa系统的全基因组分析（如图3）。为了研究通过将BRD4募集到MYOD1启动子而引起的CEM激活的潜在脱靶或间接作用的程度，研究人員分析了整个转录组（通过RNA-seq）和全基因组BRD4结合谱（通过ChIP-seq）。 仅在CEM87和sgMYOD1均存在的情况下，才将BRD4募集到MYOD1的启动子。BRD4在肌源性环境中对MYOD1具有强的正向调控作用，其中数千个MYOD的下游靶点被BRD4结合的顺式调控元件激活，但在48h时，MYOD1是少数几个获得BRD4结合的位点之一。事实上，几乎所有其他BRD4位点的结合都有所减少，这是小分子与BET溴域结合的已知效应。在转录上，MYOD1被选择性上调。

该研究合成并优化了一类能够以剂量依赖性，基因特异性方式激活内源基因表达的CEMa分子。 通过使CEMa技术适应dCas9靶向构建体，帮助人们实现使用该系统通过战略性gRNA设计从理论上靶向基因组中的任何基因。该研究已经证明了以直接的，生物学上相关的方式控制染色质景观并诱导内源性哺乳动物疾病相关基因表达变化的能力。这项dCas9–CEMa技术为靶向与疾病相关的基因提出的针对疾病作用机制的明确针对性问题铺平了道路。由于该项研究的的基因激活平台以剂量依赖性方式被化学激活，因此在靶标验证工作中可用于在广泛的靶标基因浓度范围内可视化表型和基因剂量之间的趋势的研究。