四川传统发酵香肠中几株优势乳酸菌的分离鉴定

吉莉莉，陈雪玲，魏艳，付婷婷，何丹，张崟*，赵黎明,2，王卫

(1.成都大学肉类加工四川省重点实验室，成都 610106；2.华东理工大学 发酵工业分离提取技术研发中心，生物反应器工程重点实验室，上海 200237)

四川传统发酵香肠具有独特的风味，其风味形成过程是在湿度、温度及环境微生物等综合因素作用下，通过发酵产生独特风味[1]。该香肠与国外的发酵香肠不同，口感上不会偏酸，而且更加醇厚，有回香。在四川传统发酵香肠制作过程中，乳酸菌是其风味形成的重要菌种[2]。乳酸菌可以利用糖源，发酵产生大量乳酸等有机酸，使香肠的pH降低，抑制了其他有害菌的生长，使乳酸菌在产品中具有显著的优势性[3]。因此，在四川传统发酵香肠制品中存在着大量乳酸菌。

乳酸菌发酵产生的乳酸分子，脱水可缩聚为聚乳酸[4]。聚乳酸是制备生物可降解塑料的重要原料[5]。聚乳酸塑料备受轻工业界的重视，也是近年来国家重点扶持的新材料种类。在生物医学领域[6,7]、工业和农业领域[8,9]，以及食品包装中均有应用[10]。如何获得高效产乳酸分子的乳酸菌，对聚乳酸塑料的工业制造非常关键。为此，为了获得高效产乳酸菌种，本文以四川传统发酵香肠为原料，对其中的乳酸菌进行分离、纯化和鉴定，以期为制备生物源乳酸分子提供菌种，并为开发肉制品发酵剂及传统肉制品加工提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、培养基与试剂

香肠原料肉、辅料(食盐、香辛料、醪糟、红曲米、味精等)：购自成都市十陵镇鑫大百货。MRS培养基、甘露醇培养基、PDA培养基、虎红培养基、PCA培养基：杭州微生物试剂有限公司。GEN Ⅲ 微生物鉴定板、去碳源培养基：美国Biolog公司。Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒、DNA Ladder Mix Marker、通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)：生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 主要仪器与设备

拍打式无菌均质器 宁波新芝生物科技股份有限公司；MicroStation微生物鉴定系统 美国Biolog公司；PCR仪 美国Applied Biosystems公司；凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司；冷冻高速离心机 美国BBI公司。

1.3 方法

1.3.1 四川传统发酵香肠加工工艺

原料肉→绞肉→混匀(肥肉∶瘦肉为3∶7，加入辅料)→灌肠→冷风干燥10 d→真空包装。

1.3.2 香肠中菌相分析

香肠风干10 d后，对样品中的各种微生物进行计数。在样品不同部位无菌取样25 g，剪碎，放入无菌均质袋中，加入225 mL无菌生理盐水于拍打式均质器中拍打5 min，10倍倍比稀释后，选择合适的稀释浓度，在不同的培养基平板中进行培养，每个浓度做3个重复，37 ℃，48 h后进行计数。PDA培养基和虎红培养基于25 ℃，120 h后进行计数。

1.3.3 乳酸菌菌株分离纯化

观察记录MRS培养基上生长的菌落形态，挑取优势菌落单个菌落进行革兰氏染色，并在MRS平板上划线纯化，直至整个平板和镜下观察菌落形态一致。将已纯化的菌株接种斜面于4 ℃，用于平时使用。利用瓷珠保存于-80 ℃，用于长期菌种保存。

1.3.4 菌种的鉴定

1.3.4.1 微生物鉴定系统鉴定

挑取纯化的菌落，接种于去碳源平板中，30 ℃培养24 h。用无菌棉签挑取已去碳源的菌落于IF培养基中，调整比浊度至98%左右，将IF培养基接种于GEN Ⅲ 微生物鉴定板中，每孔50 μL，置于30 ℃，培养24 h，在微生物鉴定系统中读取数据。

1.3.4.2 分子生物学鉴定

细菌基因组DNA提取：应用细菌基因组提取试剂盒提取细菌DNA，提取产物经过PCR扩增，扩增体系：Template 0.5 μL，Buffer 2.5 μL, dNTP 1 μL, 酶0.2 μL，27F 0.5 μL，1492R 0.5 μL， PCR扩增反应条件，94 ℃ 4 min预变性；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，30 个循环；72 ℃ 修复延伸10 min，4 ℃终止。PCR产物由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果与GenBank基因数据库中16S rDNA序列进行同源性比较分析，鉴定出微生物种类。

2 结果与分析

2.1 发酵香肠中的微生物数量

为了分析发酵香肠中的微生物数量，对其中的主要微生物数量进行培养计数，所得结果见图1。

图1 样品中微生物数量Fig.1 Number of microorganisms in sample

由图1可知，香肠中含有乳酸菌、微球菌、霉菌和酵母菌，其中乳酸菌为香肠中的优势菌落，数量为(7.21±0.33)log CFU/g，其次为微球菌。

由于香肠配方中添加了含有微生物的辅料醪糟，其中所自带的发酵微生物在香肠中继续生长。因此，各种微生物的含量比一般香肠高，但低于添加工业发酵剂的发酵香肠[11,12]。MRS培养基中生长的乳酸菌量较多，这就使乳酸菌的分离更加容易。

2.2 乳酸菌的分离纯化

通过对MRS平板中菌落形态进行观察，选取了3种形态有差异的菌落进行分离纯化。这3种菌在经过反复挑取单个菌落，并在MRS平板中划线，最终获得了平板与镜下形态一致的菌落。这3种菌平板上的形态表现出一定的差异，各种菌落的形态特征描述见表1。

表1 3株菌的形态特性Table 1 Morphological characteristics of three strains of bacteria

2.3 乳酸菌的微生物鉴定系统鉴定

为了进一步明确所得3株菌的种属，采用微生物鉴定系统对其进行了鉴定。GENⅢ微孔板使用固定在微孔板上的94个不同的生化试验来对广泛的革兰氏阳性和阴性细菌提供表型概况并进行鉴定，Biolog鉴定系统中的软件通过读取GENⅢ微孔板上所表现出来的表型图谱来对细菌进行鉴定。最终经过系统比对，给出最有可能的微生物种类。

3株菌接种GENⅢ 鉴定板24 h后，放置于微生物鉴定系统中进行读数鉴定，鉴定板经过24 h培养后，对碳源利用后显色见图2。

图2 GENⅢ微孔板24 h表型图谱Fig.2 24 h phenotypic spectrum of GEN III microporous plate

注：全灰色为阳性，半灰色为弱阳性，白色为阴性。

通过微生物鉴定系统读数后分析，1号菌95.3%可能性为粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)，2号菌90.4%可能性为乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)，3号菌94.1%可能性为肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)。

2.4 乳酸菌的分子生物学鉴定

为了进一步验证所得微生物的种属，对纯化得到的3株菌的16S rDNA扩增产物进行电泳分析，电泳后在凝胶成像系统下观察拍照，结果见图3。

图3 16S rDNA PCR产物电泳图 Fig.3 Electropherogram of 16S rDNA PCR products

图3中DNA的分子量大小数据显示，在约为1500 bp处出现了荧光条带，将产物送至测序公司测序，将所得到的序列在NCBI上进行BLAST同源性分析，结果见表2。

表2 3株菌的序列分析Table 2 Sequence analysis of three strains of bacteria

经过对3株菌的序列测定后，可知1号菌为粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)，2号菌为戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)，3号菌为肠膜明串珠菌，该结果只有2号菌与微生物鉴定系统的结果有差异，另外两株结果一致。由结果可知，生理生化鉴定在一定程度上与分子生物学鉴定保持一致，在实验室可作为微生物鉴定中的辅助方法。

粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)是一种典型的乳酸菌，常被用于制作奶酪等乳制品，具有提高奶酪感官特性的作用[13]，也常在发酵香肠中被分离到[14]。这种菌株若携带耐药基因，随着饮食进入人体，会通过水平转移传递给其他肠道基因[15]。目前已有研究人员将耐药性低、生物胺产量少的粪肠球菌应用于发酵香肠的制作，所制作出的香肠，感官上没有显著的变化，但是干燥结束后肠杆菌、金黄色葡萄球菌和革兰氏阳性菌含量降低，对单增李斯特菌产生抑制作用，为发酵香肠的生物保存的提供了一种有益菌[16]。因此，在保证安全性前提下，粪肠球菌对发酵香肠的保存具有积极作用。

戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)是发酵肉制品中常见的乳酸菌[17，18]，对发酵香肠中的蛋白水解有一定影响[19]。含有戊糖片球菌作为发酵剂的香肠，可增加萜类及含硫类风味物质[20，21]。肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)是乳酸菌中明串珠菌属的重要菌种，能发酵糖类产生多种酸和醇，具有高产酸能力、抗氧化能力和拮抗致病菌等能力。一般在发酵乳制品、青贮、泡菜、果酒中[22]，在发酵肉制品中的报道还不多见。肠膜明串珠菌属于异形发酵乳酸菌，只将50%的糖转化成乳酸，其余的糖则转变成酒精、醋酸及二氧化碳。在某些微生物酶的作用下，有些糖会被聚合成多糖，使香肠形成良好的风味[23]。由研究结果可知，这3株乳酸菌在香肠的风味、色泽、安全性、贮存性等方面均具有积极的作用，具有一定的应用价值。

3 结论

通过对四川传统香肠中几株乳酸菌的分离、纯化，结合微生物鉴定系统进行生理生化鉴定及16S rDNA分子生物学鉴定，得到了粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)和肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)3种乳酸菌。这3株乳酸菌在传统香肠中均具有产生乳酸，降低产品pH值的作用，对于产品的发色、风味及亚硝酸盐等有积极的作用。因此，四川传统香肠的品质、质量及安全性与其中所含有的乳酸菌有着密不可分的关系。该研究中所分离得到的3种乳酸菌，为制备生物源乳酸单体提供了菌种，并为开发肉制品发酵剂及传统肉制品加工提供了参考。