不同木质素对酶蛋白的吸附影响及酶活变化研究

牟洪燕 刘怡蓓 黄 瑾

（1. 华南理工大学制浆造纸工程国家重点实验室，广东广州，510640；2. 华南理工大学轻工与食品国家级实验教学示范中心，广东广州，510640）

天然木质纤维的主要组分是纤维素、半纤维素和木质素3种高分子物质［1］。利用天然木质纤维生产乙醇作为交通燃料，能够缓解化石能源枯竭带来的能源危机和压力。生物乙醇生产过程中，木质纤维酶水解过程是控制生产成本的关键步骤。其中，木质素对纤维素酶的无效吸附会严重阻碍酶水解效率，木质素可以通过3 种形式抑制纤维素酶的水解作用：①限制纤维素酶进入纤维素；②纤维素酶和木质素之间通过疏水相互作用、静电相互作用和/或氢键产生的不可逆吸附/非生产性吸附；③使酶失活。木质素对纤维素酶的无效吸附会使酶失活，不仅影响酶水解效率，还影响酶的回收利用。木质素物理化学性质，特别是主要官能团（如羰基、甲氧基、酚类和脂肪族羟基）、愈创木基木质素（G）、紫丁香基木质素（S）等对木质素吸附酶的亲和力影响较大［2］。Yang 等［3］在研究中发现，与纤维素酶相比，木质素更易与牛血清蛋白（BSA）结合。后来有研究者发现，通过添加表面活性剂，可降低纤维素酶在木质素上的吸附量［4-5］。郭芬芬［6］研究了不同类型木质纤维素（杨木、松木、玉米秸秆、红麻）对不同酶的吸附差异发现，木质素对外切聚葡萄糖酶和聚木糖酶的吸附最多，对内切聚葡萄糖酶的吸附较少，对β-葡萄糖苷酶的吸附最少，这是由于β-葡萄糖苷酶缺少碳水化合物结合结构域（CBM），而CBM在木质素与酶蛋白吸附过程中起着重要作用。Berlin等［7］比较了有机溶剂预处理针叶木分离提取的木质素对纤维素酶、聚木糖酶和β-葡萄糖苷酶活性的抑制作用发现，木质素对纤维素酶的抑制作用最强，而对聚木糖酶的抑制作用较小，β-葡萄糖苷酶受木质素影响最小。Kellock 等［8］发现，蒸汽爆破法预处理云杉分离获得的木质素对聚木糖酶、β-葡萄糖苷酶和纤维素酶的酶水解抑制作用比麦草木质素的强。Yu 等［9］的研究表明，在木质纤维素酶水解的过程中，木质素的存在会导致纤维素酶的无效吸附，从而降低酶水解效率，酶水解反应结束时，底物中大部分纤维素已被纤维素酶水解成可发酵糖，而吸附了大量纤维素酶的木质素则残留下来。许多研究人员针对被吸附的纤维素酶的分离方法做了许多探索。Rodrigues等［10］指出，酶水解反应体系的pH 值不仅会改变木质纤维素的活性位置，还会影响酶本身的空间构象，提高反应体系的pH 值，有利于实现已吸附酶的脱附。有研究还发现，酶脱附受温度影响，酶的空间构型及基团会随着温度的升高而发生改变，从而使得底物对酶的吸附减弱，让酶更容易游离出来［11-12］。木质素吸附纤维素酶影响酶水解的机理非常复杂，其对纤维素酶的吸附不仅与自身物理化学结构性质和纤维素酶的生物特性有关，而且受吸附反应条件（如缓冲液浓度、反应温度、时间、pH 值等）的影响［11］。不仅如此，木质纤维酶水解常用的纤维素酶是一个复合酶体系，主要由内切聚葡萄糖酶、外切聚葡萄糖酶和β-葡萄糖苷酶组成，部分还包括聚木糖酶。因此，木质素对不同酶组分的吸附影响差异，会影响各酶组分的协同水解作用，从而影响酶水解效率，更不利于酶的回收利用。

因此，本课题探究了不同预处理方法制得的两种桉木木质素与不同酶之间的吸附作用，采用比色法对比两种木质素对不同酶蛋白（纤维素酶、聚木糖酶和β-葡萄糖苷酶）的吸附和脱附影响差异，以及木质素吸附对不同酶蛋白活性的抑制影响，为今后酶回收再利用的研究提供一定理论参考。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

S3100紫外可见分光光度计（UV，美国PerkinEl⁃mer）、AXTG16G 离心机（盐城市安信实验仪器有限公司）、THZ-C 气浴恒温振荡器（金坛市成辉仪器）、恒温水浴锅等。

本课题所用桉木取自中国湛江某制浆厂，筛选4～6 mm 的桉木切片，并进行空气干燥预处理。碳酸钠、碳酸氢钠、无水乙醇（95%）等试剂均购自美国Sigma-Aldrich 公司；纤维素酶、聚木糖酶、β-葡萄糖苷酶均购自丹麦Novozymes 公司。以上所有试剂均为分析纯，无需进一步纯化可直接使用。

1.2 木质素的制备

（1） 碱木质素的制备 制备条件为：170℃、24%NaOH（w/V）、NaOH∶桉木片=4∶1（液比）条件下反应2 h，抽提桉木以制备碱木质素［13］。

（2）二甲苯磺酸钠（SXS）木质素 按照姚穆等［14］报道的方法制备水溶SXS 木质素，将分离后的SXS木质素进行冷冻干燥。根据Toledano等［15］报道的方法进行SXS木质素的纯化。

1.3 木质素对酶蛋白的吸附及酶活的影响

分别在室温和50℃条件下进行木质素对酶蛋白的吸附实验。利用蛋白标准曲线计算溶液中游离的酶蛋白含量，根据式（1）和式（2）计算酶蛋白的吸附百分比和单位吸附量。吸附完成后，将上述吸附后的底物离心干燥后置于pH值为10的碳酸盐缓冲溶液（碳酸钠-碳酸氢钠，下同）中，混合均匀后在50℃、180 r/min的气浴恒温振荡器中反应相同时间，离心后测定上清液中的游离酶蛋白含量（Mf），利用差减法计算木质素吸附的酶蛋白；溶液中总的酶蛋白含量为M。同时，利用3，5-二硝基水杨酸 （DNS） 比色法［16］和对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）［17］比色法测定木质素吸附前后的酶活。

式中，ML为木质素质量。

1.3.1 纤维素滤纸酶活

纤维素酶的酶活通常采用滤纸酶活法测定，其基本原理为，纤维素酶能把滤纸中的纤维素水解成葡萄糖，葡萄糖是一种还原糖，加入DNS 溶液共沸后，DNS会被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸，还原糖则被氧化成糖酸及其他产物，溶液变为橙红色。在一定浓度范围内，葡萄糖的含量（Mg）与溶液吸光度（反映为溶液颜色深浅）呈一定的线性关系，根据葡萄糖标准曲线可以计算出溶液中葡萄糖含量，通过式（3）计算出纤维素酶酶活（Ec） 。

式中，180 为葡萄糖的相对分子质量，200 为稀释倍数。

1.3.2 聚木糖酶酶活

采用DNS 比色法测定反应体系中的聚木糖酶酶活。聚木糖酶能将底物中的聚木糖水解成木糖，木糖也是一种还原糖，与1.3.1所述原理相同，利用UV测定溶液吸光度值后，可根据木糖标准曲线计算出反应体系中的木糖含量（Mx）［18］，根据式（4）计算聚木糖酶酶活（Ex）。

式中，150 为木糖的相对分子质量，100 为稀释倍数。

1.3.3β-葡萄糖苷酶酶活

采用pNPG 比色法测定反应体系中的β-葡萄糖苷酶的酶活。β-葡萄糖苷酶能水解pNPG，生成葡萄糖和对硝基苯酚（PNP），而PNP 溶液与Na2CO3溶液混合后会产生较深的黄色，且溶液在410 nm 处有最大吸收。通过UV 测定其吸光度，可以计算反应体系中葡萄糖苷的含量，根据式（5）计算得到β-葡萄糖苷酶酶活 （Eβg） 。

式中，N为稀释倍数。

2 结果与讨论

2.1 木质素对酶蛋白的吸附影响

在室温和50℃条件下，分别将碱木质素和SXS木质素与3种酶蛋白分别混合、吸附4 h，测定木质素对不同酶蛋白的吸附百分比，结果如图1所示。

图1 不同木质素对3种酶蛋白的吸附百分比

由图1可知，在50℃和室温条件下，碱木质素和SXS 木质素对3 种酶蛋白的吸附能力强弱顺序均为聚木糖酶＞β-葡萄糖苷酶＞纤维素酶，且50℃时，两种木质素对各酶蛋白的吸附能力均明显强于室温条件；说明升高温度有利于提高木质素对酶蛋白的吸附。有实验［11］表明，纤维素酶和木质纤维素底物结合是一个放热过程，温度升高，不利于纤维素酶与底物的结合，但木质素与酶的吸附过程与此相反，温度升高有利于木质素吸附酶蛋白。

与室温条件相比，碱木质素在50℃时对纤维素酶、聚木糖酶和β-葡萄糖苷酶的吸附百分比分别提高了8.8、19.1 和12.2 个百分点；而SXS 木质素在50℃时对纤维素酶、聚木糖酶和β-葡萄糖苷酶的吸附百分比分别提高了0.8、9.9 和7.9 个百分点；由此可知，SXS木质素对纤维素酶蛋白的吸附量受温度的影响很小，但对聚木糖酶和β-葡萄糖苷酶的吸附量受温度影响较大。

室温和50℃条件下，碱木质素对聚木糖酶和β-葡萄糖苷酶的吸附能力都明显强于SXS木质素，这可能是由于表面负电荷对聚木糖酶和β-葡萄糖苷酶在木质素上的吸附有积极影响，而碱木质素的表面负电荷量大于SXS 木质素［13］。同时，这两种木质素对纤维素酶的吸附量明显不同。吸附时间为4 h、室温条件下，碱木素和SXS木质素对纤维素酶的吸附百分比分别为2.3%和3.6%，这可能是因为，带有较高表面电荷的木质素会对纤维素酶产生更强的静电斥力，从而降低其对纤维素酶的吸附亲和力［13］；当温度为50℃时，两种木质素对纤维素酶的吸附百分比分别提高至11.1%和4.4%，说明相对于SXS木质素，碱木质素对纤维素酶蛋白的吸附更易受到温度的影响。

2.2 木质素对酶蛋白的脱附影响

根据2.1 中两种木质素的酶蛋白吸附实验结果，将吸附了酶蛋白（吸附条件：时间4 h、50℃）的碱木质素和SXS木质素过滤干燥后置于pH值=10的缓冲液中，同样在50℃下反应4 h，研究其脱附行为，结果如图2所示。

图2 不同木质素对3种酶蛋白的脱附百分比

由图2 可知，两种木质素对3 种酶蛋白的脱附能力强弱顺序均为β-葡萄糖苷酶＞纤维素酶＞聚木糖酶，且SXS木质素对3种酶蛋白的脱附效果均比碱木质素好；相同脱附条件下，碱木质素脱附了42.0%的纤维素酶，26.6%的聚木糖酶和44.5%的β-葡萄糖苷酶，而SXS 木质素脱附了61.4%的纤维素酶，32.7%的聚木糖酶和64.6%的β-葡萄糖苷酶。由此可知，碱木质素对酶蛋白的吸附要强于SXS木质素，SXS木质素则更容易实现对酶蛋白的脱附。

综合图1 和图2 可知，两种木质素对β-葡萄糖苷酶的吸附百分比均大于它们对纤维素酶的吸附百分比，但对其的脱附百分比也大于纤维素酶，这可能是因为，不含CBM 和连接域的β-葡萄糖苷酶与木质素的结合较弱［19］。

2.3 木质素吸附对酶活的影响

将两种木质素置于5 mL 的酶（酶浓度10%）中吸附4 h 后，测定溶液中游离酶的酶活，结果如图3所示。由图3可知，在室温和50℃条件下，两种木质素对3种酶蛋白的吸附均降低了酶活，且50℃时，各酶蛋白的酶活下降更多。

图3 不同木质素吸附酶蛋白对酶活的影响

两种木质素的吸附都明显降低了3 种酶的酶活，不同酶的酶活下降百分比如图4 所示。由图1 可知，碱木质素对纤维素酶的最大吸附百分比不超过12%，但其酶活在室温和50℃条件下分别下降了8.6%和15.3%（见图3（a））；而SXS木质素对纤维素酶的最大吸附百分比小于5%，却导致其酶活分别下降了25.8%（室温）和32.7%（50℃）。在室温和50℃下，碱木质素对聚木糖酶的最大吸附百分比分别为40.4%和59.5%，而对应的酶活下降了19.9%和33.8%（见图4）；而相同条件下，SXS木质素对聚木糖酶的最大吸附百分比分别为29.8%和39.7%，而对应酶活却均下降了约65%。但对β-葡萄糖苷酶而言，却存在碱木质素对其吸附量多，但其酶活下降少的现象。结合姚兰等［4］的实验结果分析，这可能是由于SXS 木质素中一些可溶的小分子质量降解产物对酶的活力具有抑制作用或使其失去活性，从而使酶活降低。不同酶组分生物化学特性不同，且不同木质素的物理化学性质对不同酶组分的影响差异较大，在以后的工作中需要更深入的研究。

图4 不同木质素吸附酶蛋白后酶活的下降百分比

3 结 论

分别以碱法和水溶预处理桉木得到的碱木质素和二甲苯磺酸钠（SXS）木质素为原料，利用比色法研究两种木质素对不同酶蛋白（纤维素酶、聚木糖酶和β-葡萄糖苷酶）的吸附和脱附影响差异，以及木质素吸附对酶活的影响，主要结论如下。

3.1 不同木质素与不同酶（纤维素酶、聚木糖酶和β-葡萄糖苷酶）的吸附和脱附实验表明，两种木质素对不同酶的吸附能力强弱顺序为：聚木糖酶＞β-葡萄糖苷酶＞纤维素酶；脱附强弱顺序为：β-葡萄糖苷酶＞纤维素酶＞聚木糖酶；其中，聚木糖酶最难脱附，被吸附的酶蛋白更容易从SXS木质素上脱附下来。

3.2 木质素吸附会显著降低酶活，升高温度虽然可提高木质素对酶蛋白的吸附能力，但也会抑制酶活。