膀胱癌甲基化相关蛋白UHRF1的表达及临床意义

林谦 章庆华 付承林 夏青青 王琼英

泛素样含PHD和环指域蛋白1（UHRF1）是新发现的一种与细胞生长有关的核蛋白基因，属UHRF家族成员之一，是首先被克隆作为一种与细胞生长有关的核蛋白基因［1］。其是一个重要的表观遗传调节因子，参与并维持DNA的甲基化。近年来，发现其在静止的细胞中表达较低，而在增殖的肿瘤细胞中表达明显增加，是一个致癌基因［2］，与多种肿瘤的发生、发展及预后有一定的关联。本研究采用免疫荧光的方法，测定膀胱癌组织及癌旁正常组织中UHRF1的表达情况，并探讨其与膀胱癌临床病理特征之间的关系。

1 材料和方法

1.1 临床资料选取2016年1月至2018年6月本院膀胱癌手术患者82例（经尿道膀胱肿瘤电切62例、膀胱部分切除2例、根治性膀胱全切18例），所有患者均为初次手术，术前未接受任何局部及全身放化疗。男62例，女20例；年龄39~84岁，平均年龄63.2岁。标本经病理确诊为膀胱癌，其中尿路上皮癌77例，非尿路上皮癌5例（鳞癌3例，腺癌2例）。同期取距离肿瘤边缘至少>2cm癌旁正常膀胱组织56个病例样本作为对照。标本均在手术切除后30min内完成采集。分别记录年龄、性别、组织学类型、组织学分级、临床分期、是否肌层浸润。

1.2 主要实验试剂鼠抗人UHRF1抗体，abcam公司，货号ab57083，规格100μg，购自匠莱生物科技（上海）有限公司。

1.3 免疫荧光方法病理标本常规石蜡切片，水化后置于二甲苯（I）1h，二甲苯（II）1h，二甲苯：酒精1∶110min，100%酒 精（I）1min，100%酒 精（II）1min，90%酒精1min，80%酒精1min，70%酒精1.5min，50%酒精1.5min，单蒸水中浸泡>2min，2h以内。37°胃蛋白酶修复30min，PBS洗3次。1%BSA室温封闭2h。UHRF1抗体用一抗稀释液稀释200x，4°湿盒孵育过夜。阴性对照组用1%BSA代替。回收抗体，PBS水洗3次，5min/次。Anti-mouse-546荧光二抗用1%BSA稀释200x，常温孵育2h。回收抗体，PBS水洗3次，5min/次。1000x稀释的DAPI染色15min，PBS水洗3次。防淬灭封片剂10μl滴在每个样本上，小圆玻片覆盖其上。全程湿盒里操作，结束后湿盒避光4°放置，1周内置荧光显微镜下拍照。

1.4 结果判断荧光显微镜下细胞内见荧光显影为UHRF1表达阳性，无荧光显影为UHRF1表达阴性。

1.5 统计学方法采用SPSS19.0统计软件。比较UHRF1在膀胱癌组织与癌旁正常组织间的表达差异；分别比较各临床病例特征（年龄、性别、组织学类型、组织学分级、临床分期、是否肌层浸润）UHFR1表达情况的差异。计数资料用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UHFR1在癌组织及癌旁正常组织中的表达82例膀胱癌组织中，UHRF1表达的阳性率为78.0%（64/82），56例癌旁正常膀胱组织中表达率为10.7%（6/56）。两者比较，差异有统计学意义（P<0.001）。见图1、2。

图1 癌旁正常组织中，未见UHRF1表达

图2 癌组织中见UHRF1阳性表达

2.2 UHFR1的表达与临床特征关系见表1。

表1 UHRF1在膀胱癌组织中的表达与临床病理特征关系

3 讨论

膀胱癌是我国泌尿生殖系肿瘤中最常见的肿瘤，男女发生率大约3∶1，好发年龄50~70岁，特点是易复发、进展，严重危害中老年人的健康。UHRF1基因是一种DNA甲基化蛋白，是维持DNA甲基化和组蛋白编码的重要表观遗传调节因子。目前已经发现并证实其在多种癌症组织如胃癌、前列腺癌、肺癌、宫颈癌及乳腺癌等中均存在过表达［3-6］。UHRF1可以破坏表观遗传密码，其表达水平的变化调节细胞周期的进展、细胞增殖和细胞迁移［7］。

本资料结果表明，相比癌旁正常组织，膀胱癌组织中UHFR1的表达明显增高，差异有统计学意义（P<0.001）。同时，对临床病理特征（年龄、性别、组织学类型、组织学分级、临床分期、是否肌层浸润）进行分析发现，在年龄、性别、组织学类型方面，UHRF1的表达并无差异，但在有关肿瘤的生物学特点组织学分级、分期、浸润程度上，UHRF1的表达差异有统计学意义（P<0.05）。高级别、临床分期较高、肌层浸润，均是膀胱癌进展和预后不佳的重要风险因素。UHRF1促进肿瘤的发生、发展的具体机制较为复杂，目前较为明确的是其通过肿瘤抑制基因如BRCA1、CDKN2A、p73和RASSF1的高甲基化引起癌细胞活化，从而促进肿瘤的进展［8］。KISS1被广泛认为能抑制各种癌症的转移，是一种抑癌基因，目前有研究表明其在膀胱癌中受到高甲基化的表观遗传学抑制［9］。过度表达的UHRF1可能增加CPG核苷酸的甲基化，沉默KISS1的表达促进膀胱癌的侵袭［10］。

此外，本组有5例属于非尿路上皮肿瘤（鳞癌3例，腺癌2例），其表达均为阳性，这与膀胱鳞癌、腺癌表现更高的恶性度及更差的预后相符合。但统计分析发现，与尿路上皮癌相比，差异无统计学意义，可能与收集病例数少有关。

综上所述，本UHRF1在膀胱癌组织中高表达，并与临床病理特征有一定关系。在膀胱癌患者中检查UHRF1的表达水平，可能具有潜在的应用价值，并可有望成为新的分子标记物及预测疾病进展的重要指标［11］。但由于受实验方法限制，本研究有一定局限性，如不能准确测定表达的具体数值。后期可以开展进一步相关机制研究，如通过体外肿瘤细胞培养，干扰RNA的方法降低UHRF1的表达，了解其对肿瘤细胞生物学行为的影响。