HPLC法测定野蚕豆根中桃叶珊瑚苷含量的研究

吴银双 李莉 单蕊 陈燕 杜冰 李海宁 姚政

【摘 要】 目的：建立HPLC法测定栽培野蚕豆根中桃叶珊瑚苷含量。方法：采用外标法，XBridge Shield C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），甲醇-水（2∶[KG-*3/5]98）为流动相，梯度洗脱;流速1.0mL/min，柱温30℃，检测波长203nm。结果：桃叶珊瑚苷的质量浓度在：12.8～74.4μg/mL内与峰面积呈良好的线性关系，R=0.9990。平均加样回收率为100.98%，RSD值为0.695% （n=9）。结论：栽培野蚕豆根中桃叶珊瑚苷2年生根、1年生根、2年生茎叶、1年生茎叶的平均含量分别为：2.4815%、0.9759%、0.3758%、0.0266%;实验采用的HPLC法操作简便、快速、准确，样品处理简便易行，适于野蚕豆根中桃叶珊瑚苷的质量控制。

【关键词】 野蚕豆根;桃叶珊瑚苷;HPLC法

【中图分类号】R284.2 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2020）24-0021-04

Abstract：Objective To establish a HPLC method for the determination of the aucubin content in the cultivated Centranthera grandiflora benth. Methods Quantitative tests were carried out by external standard method， inw which XBridge Shield C18 column （250nmx4.6nm，5μm） with methanol-water （2∶[KG-*3/5]98） as mobile phase was used for gradient elution. The chromatographic conditions were as follows： flow rate 1.0mL/min， column temperature 30℃， detection wavelength 203nm. Results The mass concentration calculated by peak area showed a good linear relationship （R=0.9990） was within 12.8～74.4μg/mL. The average recovery was 100.98%， and the RSD value was 0.695%（n=9）. Conclusion According to our experimental study， the average aubucin contents of 2-year rooting，1-year rooting， 2-year stems and leaves and 1-year stems and leaves were 2.4815%， 0.9759%， 0.3758% and 0.0266%， respectively. Results of the study showed that the HPLC method is not only simple， rapid and accurate but also has the characteristics of simple and easy sample treatment， which means it is suitable for the quality control of aubucin in the Centranthera grandiflora benth.

Keywords：Centranthera grandiflora Benth;Aubucin;HPLC

野蚕豆根，又名化血丹、小红药、金猫头（广西）、灵芝草（云南） ，原植物来源于玄参科（ Scrophulariaceae） 胡麻草属（ Centranthera） 植物大花胡麻草Centranthera grandiflora Benth，主要分布于云南、贵州、广西等地， 越南、缅甸、印度也有分布[1]。以根入药，主要载于《中华本草》《全国中草药汇编》《天然药8404种诠释》《云南中草药》《中国民族药志要》《红河天然药物》等书，具有消肿止痛、散瘀止血的功效，外用治外伤出血[2]。在云南省紅河州等地，野蚕豆根主要被用于防治多种心脑血管疾病，且疗效显著，系当地苗族地区名贵地方药。迄今为止，有关野蚕豆根的主要化学成分研究报道，主要含有环烯醚萜苷类、苯乙醇苷类、类胡萝卜素类、紫罗兰酮苷类、单萜苷类等丰富的生物活性物质[3-5]。其中环烯醚萜苷类化合物是其主要化学成分，环烯醚萜苷具有抗炎、抗肿瘤、保肝、降糖、神经系统保护作用等广泛的药理活性[6-7]，最新的研究还发现环烯醚萜苷类具有DNA合成酶抑制剂的作用，可开发成抑制DNA合成的抗肿瘤新药[5]。桃叶珊瑚苷是野蚕豆根中含量最高的环烯醚萜苷类成分[3]。桃叶珊瑚苷在抗氧化、抗炎、抗菌、抗糖尿病、保肝、抗肿瘤、神经保护及促进伤口愈合作用等功效显著[8]，能明显抑制乙型肝炎病毒DNA的复制和促进干细胞再生[9]。[JP+1]药理研究显示，野蚕豆根用药安全，无明显毒性反应，有抗凝血及抗炎活性[10-11]，对心血管疾病和大鼠急性缺血模型所到处心肌损伤有保护作用 [12-13]，泡制的酒可以防治脑血栓、脑梗[14]。该民族药疗效确切，有较好的应用前景。目前，随着野蚕豆根临床需求量的增加，其野生资源已属濒危，当地已开展人工种植。

有关HPLC法测定野蚕豆根中桃叶珊瑚苷的含量，张传利等[15-16]对其野生（根、茎、叶、花）、栽培的野蚕豆根不同部位（根、茎、叶、花、混合样）的桃叶珊瑚苷、梓醇进行含量了测定，野生的野蚕豆根桃叶珊瑚苷的含量高低为：根>茎>花>叶，根的含量远高于其他部位;栽培的野蚕豆根桃叶珊瑚苷的含量高低为：根>叶>混合样>茎>花，根中的最高含量为0.930mg/g;两种野蚕豆根中梓醇在叶中含量都是最高的。色谱柱：Agilent TC-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）;流动相：乙晴-水（3∶[KG-*3/5]97），检测波长205nm。本研究对栽培野蚕豆根1年生根、茎叶;2年生根、茎叶中的桃叶珊瑚苷分别进行含量的测定，色谱柱：XBridge Shield C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）;流动相：甲醇-水（2∶[KG-*3/5]98），检测波长203nm。建立HPLC法测定野蚕豆根中桃叶珊瑚苷含量的方法，为栽培野蚕豆根药材质量评价及采收的合理性提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters e695型高效液相色谱仪、万分之一电子天平（恒平，FA2004型）、十万分之一电子天平（岛津，SHIMADZU）、超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司，SK3300LH）、万能高速粉碎机（温岭市林大机械有限公司，DFY-C）、旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂，RE-2000A）、电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司，DZKW-D-4）、循环水真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司，SHZ-ⅢA）。

1.2 试剂 桃叶珊瑚苷对照品购自中国食品药品检定研究院（批号：111761-200601）。所用试剂均为分析纯，使用娃哈哈纯净水，甲醇为色谱醇。野蚕豆根采自云南省红河州屏边县国云种植有限公司栽培基地，经云南中医药大学李海宁老师鉴定为玄参科胡麻草属植物大花胡麻草Centranthera grandiflora Benth.的根及根茎。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取桃叶珊瑚苷对照品6.20mg，置50/mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解定容，制成0.124mg/mL对照品溶液，避光冰箱保存，备用。

2.2 供试品溶液的制备[17] 分别精密称取1年生根、茎叶、2年生根、2年生茎叶（1.0g），置于具塞锥形瓶中，加氯仿20mL，超声处理20min，滤过。药渣自然晾干后，加60%乙醇30mL，称定质量，超声处理30min，再称定质量，用60%乙醇补足损失的质量，用0.22μm微孔滤膜过滤，即得。

2.3 色谱条件及适用性实验[18-19] 色谱柱：XBridge Shield C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）;流动相：甲醇（A）-水（B）;梯度洗脱程序：0～25min 2%～98% B;25～30min 80%～20% B;30～35min 2%～98% B;流速1.0mL/min，检测波长203nm，柱温30℃，进样量：20μL。在上述色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液2μL，注入液相色谱仪。

2.4 线性关系考察 精密量取“2.1”对照品溶液1、2、3、4、5、6mL分别置于10mL容量瓶中，依次稀释定容，分别进样20μL，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得线性回归方程为：Y=6326522.085X-1747.411（R=0.9990），线性范围为：12.8～74.4μg/mL。

2.5 精密度实验 取“2.1”对照品溶液适量，按“2.3”色谱条件重复进样6次，每次20μL，记录色谱图，按峰面积计算相对偏差。桃叶珊瑚苷对照品的相对标准偏差（RSD）为1.44%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性实验 取“2.2”供试品溶液，按“2.3”色谱条件，精密吸取同一供试品溶液20μL，分别于0、2、4、6、8、10、12、24h进样，其相对标准偏差（RSD）为1.92%，表明供试品溶液在24h内表现出良好的稳定性。

2.7 重复性实验 精密称取6份药材，按“2.2”制备供试液，按“2.3”色谱条件分别进样测定，每次20μL，记录色谱图，按峰面积计算相对偏差。其相对标准偏差（RSD）为1.21%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率实验 精密称取9份已知含量的野蚕豆根药材粉末，每份0.50g，按“2.2”制备供试液，分别精密加入一定量的对照品溶液，按“2.3”项色谱条件测峰面积，计算回收率，结果显示桃叶珊瑚苷的平均回收率为100.98%，RSD=0.695%。

2.9 供试品含量测定 分别取野蚕豆根（1年生根茎、茎叶;2年生根茎、茎叶）粗粉适量，平行称取6份，按“2.2”制备供试液，按“2.3”色谱条件进样测定，记录峰面积，采用Excel 2010处理计算桃叶珊瑚苷的含量。

3 讨论

野蚕豆根主要化学成分为环烯醚萜苷类化合物，其中含量最高的桃叶珊瑚苷，也是其中的活性成分之一，是评价野蚕豆根质量标准的一个重要指标。本研究以桃叶珊瑚苷为测定指标，采用流动相甲醇-水溶液（2∶[KG-*3/5]98）梯度洗脱，流速1.0mL/min，柱温30 ℃，检测波长203nm的色谱条件，从而研究野蚕豆根中桃叶珊瑚苷的含量。实验结果表明在此条件下峰形对称性较高，无拖尾现象，测得含量稳定，重现性好，为野蚕豆根的开发与应用提供实验依据，同时也为其它药材测定桃叶珊瑚苷化合物提供参考。

野蚕豆根在云南省红河州一带资源丰富，被当地苗族广泛用于心血管系统疾病的防治，由于大量采集，现野生资源枯歇，目前在云南省红河州已經开展了大量人工种植，由于3年生野蚕豆根多发生根的腐败而导致产量降低，故一般采收1～2年生药材。本研究以桃叶珊瑚苷的含量为评价指标，对栽培野蚕豆根1年生、2年生根以及地上部份茎叶进行含量测定，桃叶珊瑚苷2年生根、1年生根、2年生茎叶、1年生茎叶的平均含量分别为：2.4815%、0.9759%、0.3758%、0.0266%。

2年生根、茎叶的桃叶珊瑚苷含量远远高于1年生根、茎叶的含量，为野蚕豆根药材2年采收的合理性提供理论依据。

野蚕豆根主要化学成分是环烯醚萜苷类化合物，环烯醚萜苷类化合物在自然界中分布广泛，是具有多种药理活性的天然产物，有很高的药用价值，其根中的桃叶珊瑚苷是含量最高的化合物。近代研究，野蚕豆根泡制的酒可以防治脑血栓、脑梗[14]，也明确了野蚕豆根作为防治心脑血管疾病候选新药的开发价值，根作为原料还可以在新型药物、抗肿瘤、保健食品、化妆品的添加剂等开发方面具有广阔的前景。

参考文献

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志（第六十七卷第二分册）[M].北京：科学出版社，1979：344-346.

[2]《中华本草》编委会，国家中医药管理局.中华本草[M].上海：上海科学技术出版社，2005：330.

[3]廖立平，张紫佳，胡之壁，等.大花胡麻草环烯萜苷类化学成分研究[J].中草药，2012，12（43）：2369-2371.

[4]梁钜忠，张嘉硕，马孝本，等.大花胡麻草（Centranthera grandiflora）中化学成分的鉴定[J].植物学通报，1984（Z1）：47-43.

[5]胡琼.野蚕豆根的化学成分研究[J].中医临床研究，2016，8（22）：49-53.

[6]董天骄，崔元璐，田俊生，等.天然环烯醚萜苷类化合物研究进展[J].中草药，2011，42（1）：185-194.

[7]薛长松， 徐晶， 李萃萍， 等. 环烯醚萜苷类化合物体内代谢及代谢物药理活性研究进展[J].中国中药杂志， 2018， 43（1）： 39-45.

[8]韩曼飞，张刘强，李医明.天然桃叶珊瑚苷及其衍生物的化学结构和药理作用研究进展[J].中草药，2017，19（48）：4105-4113.

[9]刘军海，裘爱冰，任惠兰.正交实验优化杜仲叶中桃叶珊瑚苷提取工世[J].食品研究与开发，2008，29（1）：99-4102.

[10]廖立平.化血丹化学成分与活性研究[D].上海：上海中医药大学中药研究所，2014.

[11]杨抒雨，侴桂新.民族药野蚕豆根抗心肌缺血和抗凝血作用研究[J].时珍国医国药，2017，28（9）：2099-2103.

[12]ZHANG X D， LI C X， WANG L C， et al. Analysis of centranthera grandiflora benth transcriptome explores genes of catalpol， acteoside and azafrin biosynthesis [J]. Int J Mol Sci， 2019， 20（23）： 6034-6064.

[13]YANG S Y， CHOU G X， LI Q L. Cardioprotective role of azafrin in against myocardial injury in rats via activation of the Nrf2-ARE pathway [J]. Phytomedicine， 2018（47）： 12-22.

[14]红河州药学会，红河州食品药品监督管理局.红河天然药物（第一卷）[M]. 2013.

[15]张传利，李维峰，马晓，等.野生化血丹不同部位中梓醇与桃叶珊瑚苷含量的比较[J].中国药房，2019，30（19）：2623-2627.

[16]张传利，赵秀，朱春梅，等.HPLC法测定大花胡麻草不同部位中2种环烯醚萜苷成分含量[J].中国民族民间医药，2019，28（18）：29-32.

[17]烏仁曹布道，王青虎，那仁朝克图，等.蒙药芯芭中6个环烯醚萜苷的HPLC定量分析[J].中国药学杂志，2018，53（24）：2118-2122.

[18]褚洪标，陈冬，王茜.抗焦虑天然药物中桃叶珊瑚苷的闪式提取及高效液相色谱测定[J].时珍国医国药，2016，27（7）：1578-1580.

[19]李茂星，曹馨元，陶锐，等.HPLC测定马先蒿属植物中的桃叶珊瑚苷[J].华西药学杂志，2015，30（6）：718-719.

（收稿日期：2020-04-29 编辑：程鹏飞）