COMM域蛋白5参与血液透析患者甲状旁腺切除术后血压下降的机制

陈雪芹 李博厚 张凤霞 连智雯 蒋 楠 温似春 吴 琼 夏郁彬柯贵宝 张 鸿 邝素娟 邓春玉1，3， ，刘双信

继发性甲状旁腺功能亢进(SHPT)是血液透析(HD)患者的常见并发症之一，增加了慢性肾脏病(CKD)患者的死亡率[1-2]。甲状旁腺切除术(PTx)是治疗重度SHPT重要措施之一，降低甲状旁腺素(PTH)的同时，改善患者钙磷代谢，降低血压，甚至使正常血压变为低血压[3]。但是低血压容易造成透析患者血管通路血栓形成，动静脉内瘘闭塞，增加心血管病发病率和死亡率，影响患者的生存质量[4-5]。但目前PTx降低血压的机制尚不清楚。

早期在研究[6]自发性高血压大鼠的甲状旁腺中发现了COMM域蛋白5(COMMD5)。

COMMD5具有多种生物学功能：(1)COMMD5通过增加细胞周期长度和G2/M细胞周期积累，促进细胞的分化，抑制细胞增殖并促进自噬细胞死亡。 (2)COMMD5通过转化生长因子α(TGF-α)自分泌环机制增加肾细胞迁移。 (3)COMMD5通过调节细胞增殖和迁移以及促进细胞再分化来加速缺血性损伤后的肾小管修复。 (4)COMMD5通过启动子甲基化促进(ErbB)2/HER2的去磷酸化，充当肾细胞癌的“抑癌基因”[7-8]。

COMMD5与血压可能存在关联，但在HD患者中，PTx降低血压与COMMD5水平的关系尚未有文献报道。因此，本研究拟通过临床研究和实验研究两部分，分别探讨HD患者PTx前后血压变化和血清COMMD5变化水平的关系，以及内皮细胞实验检测COMMD5是否影响心房利钠肽(ANP)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS) 表达，旨在进一步探究甲状旁腺切除对血压影响的机制，为临床治疗PTx术后低血压提供新的思路。

对象和方法

临床研究研究对象共纳入31例行PTx的HD患者。手术指征:(1)临床症状明显：骨痛、骨质疏松、皮肤瘙痒，皮肤呈进展性钙化等；(2)药物治疗无效的高血钙、高血磷；(3)血清PTH>800 pg/ml；(4)超声检查或ECT提示甲状旁腺增生。符合上述(1)～(3)中任意一项及(4)者。手术方式：甲状旁腺全部切除(双侧)+ 甲状旁腺自体移植术。

观察指标比较患者PTx术前术后血压、钙、磷、钾、PTH、COMMD5变化情况，收集患者术前PTx术前2天，术后3天的血清及血压。

血清搜集清晨采集患者空腹静脉采血5 ml，3 000 r/min离心10 min，取上清置于-80℃冰箱冻存, 以备后用。

血清检测使用人含COMM域蛋白5(COMMD5)ELISA试剂盒，操作均按试剂盒说明书进行。

实验研究

实验试剂 DMEM培养基(Gibco)；胎牛血清(FBS)；0．05%胰酶(Gibco)；β-actin抗体(Abcam)；COMMD5抗体(NovoPro)；eNOS抗体(Abcam)；ANP抗体(ABclonal)；COMMD5重组蛋白(武汉华美);人含COMM域蛋白5(COMMD5)ELISA试剂盒(上海酶联生物)。

细胞培养 肺微血管内皮细胞(PMVEC)从中科院细胞库购买,在含10%FBS的DMEM培养基、37℃含5%CO，培养箱中培养。

实验分组

COMMD5重组蛋白处理组 预实验使用不同浓度的COMMD5重组蛋白(0、1 ng/ml、2 ng/ml、4 ng/ml、10 ng/ml)刺激血管内皮细胞，根据COMMD5的浓度与内皮细胞血管活性物质释放的量-效关系，最终选定在六孔板中(设复孔)，当细胞融合达到70%～80%时，采用4 ng/ml的COMMD5重组蛋白干预细胞24h。

空白对照组(Con组) 加入与COMMD5蛋白等体积的DMEM培养基。

Western印迹细胞干预到时间后，每皿加入100 μl蛋白裂解液刮取蛋白，BCA法测得蛋白浓度后按照20∶ 1加入变性液，98℃变性10 min，按照每孔50 μg上样蛋白，80V恒压电泳分离后，200 mA恒流120 min湿转至PVDF膜上，用5%牛奶封闭1h，一抗4℃孵育过夜，用相应二抗4℃孵育2h，用电化学发光液(ECL)曝光，Image J软件分析灰度值。

统计学方法利用《SPSS 26.0》进行统计分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示，不符合正态分布的计量资料用中位数(四分位数间距)表示。符合正态分布的计量资料前后比较用配对T检验；不符合正态分布的计量资料前后比较用Wilcoxon秩和检验，相关性分析使用Pearson相关性分析。组间比较用Mann-Whitney U检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

甲状旁腺切除对血压和COMMD5的影响

患者的临床情况 研究共纳入31例行PTx的HD患者，平均年龄44.23±8.57(25～66)岁，男性17例，女性14例。中位透析龄为6(5～8)年；血清肌酐为(901.33±290.84)μmol/L。原发肾脏疾病分别为：慢性肾小球肾炎16例，高血压肾病9例，糖尿病肾病3例，梗阻性肾病1例，多囊肾1例，其他病因1例。

PTx前后降压药使用情况 31例患者中，有11例患者未使用降压药物，7例患者使用1种降压药物，5例患者使用2联降压药物，7例患者使用3联降压药物，1例患者术前使用4联降压药物控制血压，所有患者在研究期间均未改变药物的种类和剂量。

PTx前后血压变化 患者PTx前收缩压和舒张压分别为(148.81±18.14)和(88.74±10.92) mmHg，术后分别为(140.58±20.55)和(75.48±12.83) mmHg。相较PTx前，患者术后收缩压(P<0.05)、舒张压(P<0.0001)下降(表1)。

PTx前后血清COMMD5变化 患者PTx术前血清COMMD5水平为0.65(0.43～1.07) ng/ml，术后为0.97(0.64～1.79) ng/ml。相较PTx术前，患者术后血清COMMD5水平升高(P=0.002)(表1)。

表1 血液透析患者PTx前后血压、实验室检查数据比较

PTx前后血压变化和COMMD5变化的相关性 患者PTx前后收缩压变化水平(ΔSBP)与COMMD5变化水平(ΔCOMMD5)呈负相关关系(r=-0.57；P=0.000 7)，舒张压变化水平(ΔDBP)与COMMD5变化水平(ΔCOMMD5)呈负相关关系(r=-0.36；P=0.043 6)(图1)。

图1 血液透析患者PTx前后血压变化和COMMD5变化的相关性分析PTx：甲状旁腺切除术；ΔSBP：PTx后SBP-PTx前SBP;ΔDBP：PTx后DBP-PTx前DBP;ΔCOMMD5:术后COMMD5-术前COMMD5；COMMD5:含COMM域蛋白5；使用Pearson相关分析；n=31;a:患者PTx前后收缩压变化水平(ΔSBP)与COMMD5变化水平(ΔCOMMD5)呈负相关关系(r=-0.57;P=0.000 7);b:患者PTx前后舒张压变化水平(ΔDBP)与COMMD5变化水平(ΔCOMMD5)呈负相关关系(r=-0.36;P=0.043 6)

COMMD5重组蛋白对血管内皮细胞血管活性物质表达的影响预实验分别采用浓度为0、1 ng/ml、2 ng/ml、4 ng/ml、10 ng/ml的COMMD5重组蛋白刺激血管内皮细胞24h，在COMMD5浓度为4 ng/ml时，ANP蛋白的相对表达量最高，eNOS蛋白表达量也在较高水平(图2)。

图2 COMMD5重组蛋白刺激对血管内皮细胞血管活性物质表达的量-效关系COMMD5：COMM域蛋白5;ANP:心房利钠肽；eNOS:内皮型一氧化氮合酶；A:COMMD5重组蛋白刺激对ANP表达量-效关系；B:COMMD5重组蛋白刺激对eNOS表达量-效关系；C：COMMD5重组蛋白刺激下，ANP和eNOS蛋白的表达

在COMMD5重组蛋白刺激24h后，Western印迹结果显示血管内皮细胞中ANP蛋白的表达量是 Con组的2.39倍，p=0.017 9；eNOS蛋白的表达量是 Con组的2.70倍，P=0.0005(图3)。

图3 COMMD5重组蛋白刺激下，血管内皮细胞的eNOS与ANP蛋白表达增多COMMD5：COMM域蛋白5;ANP:心房利钠肽；eNOS:内皮型一氧化氮合酶；Con:空白对照组；A:COMMD5的蛋白水平关系；B:ANP的蛋白水平表达；C:eNOS的蛋白水平表达;*:与Con组相比，P<0.05;***:与Con组相比，P<0.01

讨 论

在原发性甲状旁腺功能亢进患者[9-10]、血液透析患者[11-14]以及肾移植受者中[15-17]，PTx术后血压均有不同程度的降低。但切除甲状旁腺对血压的调节机制尚不清楚。早期研究认为，PTx术后血钙的减少和血压降低之间有显著的相关性，认为与PTx术后血管壁钙外流有关[10-12]。本次研究结果显示HD患者PTx术前术后血钙的差异不具有统计学意义，这与患者术后治疗性补钙有关,每隔6h静脉缓慢滴注1次10%葡萄糖酸钙(10～80 ml)，4次/d，根据监测的血钙浓度调整补钙量[18]。

文献报道甲状旁腺存在甲状旁腺高血压相关因子(parathyroid hypertensive factor，PHF)，但当时未能克隆其基因及分离纯化对应蛋白[19]。直至2000年Solban等[6]根据 PHF 的推定氨基酸序列在自发性高血压大鼠的甲状旁腺中克隆出高压相关的钙调节蛋白COMMD5。COMMD5含225个氨基酸质，在细胞核表达,受细胞外的钙负向调控, 甲状旁腺细胞在低钙刺激下，COMMD5呈高表达[20]。COMMD5 不仅在甲状旁腺中高表达，在心脏、肾上腺及肾脏小管中也有高表达。

在过表达COMMD5 的人胚肾(HEK293)和 Madin-Darby 犬肾(MDCK)-C7 细胞系中，与对照相比，COMMD5 过表达细胞释放出的ANP是对照的4.5～8倍[21]。ANP可使血管舒张，降低外周阻力，也可使心搏出量减少，减慢心率，减少心输出量，从而降低血压, 在血压平衡中起着关键作用。在敲除ANP的小鼠中，血压高于野生型小鼠52倍[22]。有研究在Na+限制性继发性高血压大鼠中，皮下注射ANP类似物(MANP)具有降低血压的作用[23]。既往研究发现，罗格列酮上调 COMMD5 及eNOS的水平，使 NO 水平增加[24]。eNOS是内皮组织特异度蛋白，其代谢产物NO 激活可溶性鸟苷酸环化酶合成环磷酸鸟苷，从而发挥舒张血管,维持血管内稳态的功能[25]。

本研究首次发现HD患者PTx后COMMD5血清水平升高，且患者PTx前后血压变化和COMMD5变化呈显著的负相关关系，提示PTx后血压降低的发生可能除了PTH、钙离子等传统因素外，还跟 COMMD5血清水平升高有关。同时本研究验证了COMMD5能够上调ANP、eNOS表达，提示COMMD5可能与增强血管舒张功能相关。这一发现可能明确COMMD5对慢性肾脏病血压的影响，为其治疗提供新思路。

本研究发现在PTx后，血清COMMD5水平并没有因为甲状旁腺的切除降低，反而较术前升高，其升高的机制可能与PTH负调节COMMD5有关，PTx后低PTH使COMMD5在它器官组织中表达增加，具体机制还需进一步探讨。本研究观察时间较短,术后长期的血压监测对于透析时和透析间期的血压管理更有临床意义，我们将在以后的研究中延长随访时间。另外本文对COMMD5的研究，仅有体外实验，暂未进行体内的研究，后续我们将在SHPT大鼠模型中进一步探究。

小结：COMMD5与HD患者PTx术后血压降低显著相关，COMMD5可能通过上调ANP和eNOS调控血压，其具体调控机制仍需今后进一步探讨与研究。