禽白血病的研究现状

2020-01-19张海龙焦贺静李蕴玉李佩国张志强张香斋

河北科技师范学院学报 2020年3期

葛成，张海龙，陈玥，焦贺静，李蕴玉，李佩国，张志强，张香斋

(河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室，河北秦皇岛，066600)

禽白血病(Avian Leukosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)引起的对家禽危害较大的一种以垂直及水平传播的肿瘤性疾病。病毒分类委员会报告，ALV类属于反转录病毒科、正反转录病毒亚科、甲型反转录病毒属[1～3]。AL在我国被列为二类动物疫病，国务院发布《国家中长期动物疫病防治规划(2012～2020年)》将其列为养禽业必须净化的疫病之一[4,5]。为尽早达到国家对AL净化的要求，从理论上指导各养殖场防控该病，为此展开综述。

1 病原学

1.1 ALV的分类

按照病毒囊膜糖蛋白抗原特异性、病毒干扰试验及宿主范围将ALV分为A～K 11个亚群[6,7]，从鸡群分离到的有A～E，J，K亚群，其中E亚群为内源性病毒，致病性弱或无致病性，其余为外源性病毒，以J亚群传染性及致病力最强[8]。J亚群是由Payne等[9]于1988年首次从商品代肉用鸡中分离。1999年J亚群首次在我国商品代肉鸡中检测发现[10]。目前，J亚群在我国各个品种鸡群中均有存在。ALV在临床上可导致鸡发生淋巴细胞性AL，成红细胞性AL，成髓细胞AL，髓细胞样AL[11,12]。研究表明，J亚群是由外源性ALV和内源性ALV重组而成，主要引起传染性致骨髓细胞瘤疾病或成髓性白血病[8]。

1.2 ALV的结构特征

ALV是反转录病毒，具有脂质囊膜，病毒粒子为20面体对称性的近似球形结构[13]。病毒粒子从外到内分为3层结构，外层是来自于宿主细胞膜的类脂质囊膜，在其表面分布有特征性的放射状突起即纤突，直径约8 nm；其中间层即为病毒的内膜，是一种20面体衣壳，直径约为60 nm；最内层是致密的核心，直径为35～45 nm，核心结构的组成成分由二倍体 RNA 和核衣壳、反转录酶、整合酶、蛋白酶组成[14]。

1.3 ALV的理化特性

ALV对外界环境抵抗力较弱，对脂溶性溶剂、去污剂和甲醛敏感，但对紫外线有一定的抵抗力[15]。pH值在4.5～9.0保持稳定，不耐高温，温度在60 ℃时 42 s 失活，温度在56 ℃时30 min 失活；温度在37 ℃时下半衰期为100～540 min，平均为260 min。因此，热不稳定性成为保存病毒最重要的因素。当温度低于-60 ℃以下时，ALV可保存几年而不降低感染力，反复冻融亦可使病毒裂解释放群特异性抗原p27，进而变于ALV的检测。

1.4 ALV基因组

ALV基因组是二聚体结构，由单股、正链、线性RNA等3种结构组成，全长约为7.2～7.8 kb。RNA存在于病毒粒子中，但并不具有感染性，两分子的RNA在各自的5′端由氢键相连。除此之外，基因组RNA的一分子还与来自特异宿主的一分子tRNA相连，在反转录过程中病毒RNA生成DNA的引物。病毒基因组RNA单体结构在反转录过程中类似于真核细胞的mRNA，5′端为甲基化的帽子结构，3′端为 ploy(A)[1，2]。

1.5 ALV蛋白结构

ALV编码区主要编码Gag，Pol及Env蛋白，分别为病毒群特异性和蛋白酶、反转录酶及囊膜糖蛋白[16]。

1.5.1Gag基因编码的蛋白Gag基因长约2 100 bp，核苷酸序列高度保守，非糖基化结构蛋白是ALV内部编码的主要基因之一，由其编码的蛋白主要分为基质蛋白(MA)p19，p10蛋白，衣壳蛋白(CA)p27，核衣壳蛋白(NC)pl4及酶蛋白中的蛋白酶(Pro)p15，其中p19主要起连接作用，p10和早期感染及后期病毒装配相关[17]，主要维持病毒粒子的近球形结构。病毒的重要核心组成为p27，它是主要的群特异性抗原，不同亚群之间核苷酸序列高度保守，以此利用ELISA检查ALV的抗原位点。p14与基因组RNA密切结合，主要负责RNA的加工和包装，p15主要对蛋白的前体进行剪切，参与Gag和Pol前体蛋白的水解过程，从而生成成熟蛋白质，组合病毒粒子。

1.5.2Pol基因编码的蛋白Pol基因长约2 600 bp，其内部的核苷酸序列非常保守，编码的主要有反转录酶(RT)p68和整合酶(IN)p32[18]，p68和p32主要作用是介导ALV的cDNA基因组整合进宿主，这一步骤是反转录病毒复制进程中的关键环节，进而使Pol基因在ALV侵染宿主细胞中发挥了重要作用。

1.5.3Env基因编码的蛋白Env基因主要对2种囊膜基因糖蛋白进行编码，即囊膜糖蛋白gp85和跨膜糖蛋白gp37[19]。Env基因主要与病毒的抗原性、致瘤类型及宿主范围密切相关，是致瘤的关键基因，不同亚群之间Env基因核苷酸序列差异很大，其中J亚群Env基因与其他亚群核苷酸序列同源性仅为40%左右，而其他亚群间核苷酸序列同源性可达80%～85%。进而说明，在J亚群Env基因中存在J亚群特异性表位抗原[20]。

ALV gp85中有5个重要区域，2个高变区hr1和hr2，是主要的受体相互作用区域[21,22]，3个可变区vr1，vr2和vr3，vr3在决定受体识别的特异性中发挥作用[23]。ALV各亚群间群特异性由2个高变区和1个可变区(vr3)决定，不同ALV毒株间差异性取决于该3区的变化。研究发现，ALV的hr1，hr2和vr3中，以hr1和hr2区核苷酸序列变化明显，亲水性较好的为hr1和hr2，这种亲水性主要体现为hr2拥有特征性的弯曲回旋结构[24]。进一步研究发现，J亚群hr2区在病毒与宿主细胞膜表面受体结合时发挥了主要作用，J亚群Env基因呈现高度变异的是hr1和vr3区，和其他亚群相比，在很大范围内可能有利于J亚群ALV较好地避开宿主的天然免疫[25]。gp85基因中拥有病毒受体决定簇，而且能够诱导宿主产生中和抗体，病毒亚群特异性也由其决定，其序列的高度突变可使宿主范围改变，因此，使ALV得以拥有跨种传播的潜力[26,27]。

ALV gp37中有3个功能区，为胞外区、跨膜区和胞内区，能够与gp85相结合的结合区分布于胞外区，胞外区具有超螺旋结构，能够介导病毒与细胞膜进行融合。当gp85与宿主细胞受体进行结合，便会启动跨膜蛋白一系列结构变化，使病毒囊膜与宿主细胞膜拉近，进而释放能量使病毒囊膜与宿主细胞膜融合，由此病毒粒子释放到宿主细胞。

2 流行病学

2.1 宿主范围

依据ALV宿主特异性是由囊膜糖蛋白决定的这一特性，从目前的研究中发现，鸡是ALV的自然宿主，宿主范围包括雉鸡、鸽、鹧鸪等一些野鸟类[28～31]。研究ALV持续带毒理想的试验动物为鸭，给鸭胚接种ALV，其病毒可在鸭胚中存活3年且不出现中和抗体及病毒血症。

2.2 传播途径与传染源

ALV主要通过垂直和水平两种方式进行传播，其中以垂直传播为主[32]。ALV在传播过程中，传染源主要为病鸡、带毒鸡和被感染的种蛋，而起至关重要作用的是带毒鸡。病毒繁殖存在于带毒母鸡的整个生殖系统当中，病毒浓度最高的部位为输卵管，特别是蛋白分泌部，因此产出带毒鸡蛋，孵出的雏鸡也携带有病毒。这种先天性感染的雏鸡常有免疫耐受现象，其不产生抗肿瘤病毒抗体，长期带毒排毒，成为重要传染源。鸡群感染ALV后，存在4种血清类型，即无病毒血症，有抗体；无病毒血症，无抗体；有病毒血症，无抗体；有病毒血症，有抗体。

3 临床症状及病理变化

感染ALV的鸡群主要表现生长迟缓、高死亡率、免疫抑制及肿瘤多样性，所感染毒株的不同，所呈现出来的临床症状和病理变化也不一样，其中最为常见是淋巴细胞性AL，成年鸡易感，产蛋前期发病率较高[18,25]。病鸡表现食欲不振，精神萎靡，鸡冠苍白，消瘦，排灰白色稀粪，腹部膨大。剖检可见，心、肝、脾实质性器官出现大小不一的肿瘤，呈弥漫性或结节形，肝脏肿大。成红细胞性AL是较少见的一种类型，临床上可见的类型有成红细胞大量增生型和血液中只含有少量的未成熟的细胞贫血型，成红细胞增生型在临床当中较为常见。病鸡表现鸡冠苍白、消瘦、腹泻、精神不振、全身性贫血。剖检可见，增生型肝、脾、肾等脏器出现肿瘤结节且呈樱桃红色或暗红色弥漫性肿大。贫血型则表现为内脏萎缩，其中以脾脏萎缩最为严重。对病理组织进行切片镜检可见，大量的成红细胞在骨髓和肝脏的窦状隙及毛细血管内积聚。成髓细胞AL是较少发生的一种类型，主要见于成年鸡。临床可见鸡只贫血，消瘦，毛囊出血等。剖检可见病鸡心、肝、脾等实质性器官呈现灰白色弥漫性肿瘤结节。髓细胞样AL是极少见的一种类型。临床上可见精神低迷，食欲不佳，消瘦，贫血。病理组织切片镜下观察可见骨髓细胞特异性生长。

4 诊断

AL可依据流行病学及临床症状和病理变化进行初步判断，但确诊需进行实验室检测，主要包括病毒的分离鉴定、聚合酶链式反应技术、酶联免疫吸附试验、免疫荧光技术、快速检测试纸条、核酸斑点杂交试验等[32]。

4.1 病毒分离鉴定

ALV的分离与鉴定被认为是最可靠的诊断方法。ALV的分离常选择的样品为全血、血浆、血清、鸡体多种软组织及10～11日龄鸡胚等[33,34]。病毒的分离一般通过DF-1细胞或CEF细胞进行，进而利用特异性单克隆抗体接种细胞进行间接免疫荧光试验进行ALV毒株的分离鉴定[35]。

4.2 PCR技术

PCR技术的特点是灵敏度高，为此，在病原鉴定、流行病学调查等一系列生命科学领域的研究中广泛使用。在ALV鉴别诊断上，Kim Y等[36]于2012年将反转录聚合酶链反应半定量(QC-RT-PCR)方法应用到 ALV-J 的实时检测中。

4.3 酶联免疫吸附试验(ELISA法)

ELISA是在临床上应用较普遍的检测方法。其原理是将群特异性抗原血清中的抗体利用荧光标记处理或酶处理，制作成荧光抗体或酶标抗体检测群特异性抗原。1979年，英美等国相继报道了利用ELISA方法检测ALV，我国于1991年起开展了双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测ALV[37]。当前，市场上有许多针对ALVp27抗原及ALV-A,B,J抗体检测的ELISA试剂盒，不同厂商间的试剂盒灵敏度和特异性存在差异。在净化进程中，由于p27抗原是ALV所有群均具有的，不区分内源性病毒和外源性病毒，所以，直接对胎粪、蛋清等样品进行ALV p27抗原的检测，检测结果容易出现假阳性。因此，结合病毒分离鉴定更为可靠有效。

4.4 间接免疫荧光技术

2001年，秦爱建等[35]通过制备ALV-J特异性单克隆抗体建立了免疫荧光检测ALV-J抗原和抗体的方法，且能够保证检测方法均具有高度特异性。应用免疫荧光技术适用于样品数量较少时，进而代替ELISA，降低检测成本，提高检测准确度。免疫荧光技术在检测ALV疑似病例及鸡体器官肿瘤方面起到了重大作用。

4.5 快速检测试纸条

快速检测试纸条是采用胶体金免疫层析技术以硝酸纤维膜为固相载体，其中的示踪标记为胶体金，使得抗原与抗体能够形成免疫复合物从而显色的一种检测技术。崔贺等[38]通过对比试验发现，胶体金试纸条的检出率远低于ELISA试剂盒检出率，目前胶体金试纸条还无法完全替代ELISA检测试剂盒。

4.6 核酸斑点杂交试验

核酸斑点杂交试验是将获得的DNA点于尼龙膜上变性固定，最后与用地高辛标记的探针对ALV各个亚群的特异性探针杂交，通过是否着色进行检测样品当中的病毒基因序列，进而判断是否感染ALV[24,26]。该方法不仅区分外源性病毒和内源性病毒，还可以区分A，B和J亚群。其利用的是特异性核酸探针交叉斑点试验具有方法简便快速、特异、灵敏、结果直观等特点，在诊断ALV中具有重要意义。

目前，确诊鸡群中是否感染ALV的常用的方法主要是PCR技术，ELISA，间接免疫荧光技术等。

5 防控

5.1 加强检疫，控制垂直传播

目前，对ALV还没有合适的疫苗和有效的药物可用来对抗，因此，只有早期检测及严格淘汰种鸡，经过持久地净化从而达到种群纯净的目的[39,40]。国际净化AL的金标准是对核心鸡群在68日和168日龄分2次全部采用血浆接种DF-1细胞，培养9 d后检测p27抗原，阳性淘汰，对于留种的下一代进行1日龄胎粪检测，淘汰同一家系的阳性鸡，如此反复进行。世界上各大型种禽场对ALV已基本达到净化标准。然而，我国基于的现状是养殖场数量多、分散，尤其自繁自养的地方鸡种群ALV感染问题相当严峻。在面对我国基本国情及鸡群品种复杂的条件下，我国也制定了适用于原种鸡场AL净化体系，形成了国家标准《原种鸡群禽白血病净化检测规程》，各地方在国家标准的前提下，制定了适合本地区的净化方案，许多种鸡场也在积极开展地方品种鸡和培育的黄羽肉鸡、蛋用型鸡的AL净化工作，并取得了一定成效，如张桂枝等[41]报道，河南省某地方品种核心鸡群经过2个世代的ALV净化，其ALVp27 抗原阳性率由20.06%下降到4.73%，ALV分离阳性率由13.04%降低到2.17%。张锐等[42]采用随机效应模型分析了全国297个规模养鸡场疫病净化对其后代繁育的影响，结果显示，与未净化鸡场比较，已净化鸡场的日最高产蛋率、种蛋合格率、种蛋受精率、受精蛋孵化率分别比提高了1.091%，1.090%，0.892%，0.528%。

5.2 加强饲养管理，控制水平传播

除了控制好垂直传播，AL的水平传播也不可忽视。根据ALV感染的机率及结合AL的特点，水平传播主要发生在孵化期间和出雏后的前两周内，在出雏厅的雌雄鉴别、免疫及苗箱之内雏鸡啄食胎粪等机率都会增加。因此，控制水平传播关键是控制好孵化、出雏、生产和免疫等环节。对原种鸡群应采取单家系入孵与出雏，并按家系单笼饲养，鸡笼间加纸板阻隔，实现笼与笼之间“只闻鸡鸣，不见鸡面”，避免直接接触。所用疫苗应严格检测，坚持应用安全高效的生物制品，杜绝禽白血病病原感染，不同家系的免疫应更换针头，避免注射器传播。