番茄遗传图谱与基因定位研究进展

杜海东，游 茜，李毅丰，毛秀杰，张 宁，王 帅

(河北科技师范学院园艺科技学院，河北 秦皇岛，066600)

番茄(SolanumlycopersicumL.)是研究植物遗传学、分类学、生理学、分子生物学等学科的重要实验材料。现阶段番茄育种目标主要集中在：增产量、提品质、多抗性、促早熟等[1]。但传统育种技术对土地面积需求较大、容易受外界环境条件影响、育种效率低、周期长；而分子标记辅助选择(Molecular Marker Assisted Selection，MAS)育种可以在分子水平上直接反应遗传本质的优点，快速、准确地筛选出目标性状，缩短育种时间，加快种质资源创新进程。分子标记辅助选择育种将会成为现代作物遗传育种的主要潮流，而获得与目的基因紧密连锁的分子标记是分子标记辅助选择育种的重要基础，实现这一目标的主要手段便是构建高密度遗传图谱[2]。

遗传图谱是依据染色体交换与重组，以多态性的遗传标记为“路标”，以标记间重组率为“图距”，确定不同多态性标记位点在每条连锁群上排列顺序和遗传距离的线性连锁图谱[3，4]。高密度、高分辨率遗传图谱的构建是进行基因定位、基因克隆、基因结构与功能研究和标记辅助选择育种的前提。

构建遗传图谱包括：(1)选择用于建立作图群体的亲本组合；(2)构建研究所需的暂时或永久性作图群体；(3)选择合适的对群体基因型进行鉴定的多态性分子标记；(4)对标记基因型数据进行连锁分析，应用作图软件绘制遗传图谱[5]。

1 番茄遗传图谱的研究

1.1 基于AFLP，RAPD，SSR，RFLP等分子标记的遗传图谱

早在1926～1931年间，MacArthur开始绘制番茄遗传图谱，但只锁定了20个基因的近似位置。20世纪80年代初，Rick以同工酶为标记绘制了番茄经典遗传图谱，鉴定出300多个遗传标记，但都是基于形态、细胞等标记所构建的遗传图谱，标记数量少、多态性低、极大限制了其应用。

Tanksley等[6]以普通栽培番茄VF36-Tm2a和潘娜丽番茄LA716为亲本，通过杂交获得的67株F2群体，以RFLP标记技术为主，使用软件绘制了番茄第一张总长1 276 cM，含有1 030个遗传标记，标记间平均距离1.2 cM，覆盖12个连锁群组成的高密度遗传图谱。该图谱与之前所构建的经典图谱相比：图距缩小，标记密度显著提升，同时也带动更多遗传图谱的研究如雨后春笋般地在全世界范围内开展起来。

Grandillo等[7]以优良加工品系(CV'M82-1-7')和近缘野生种(LA1589)杂交后代BC1群体(257株)，将120个标记(115个RFLP，3个RAPD和2个形态标记)定位于总长1 279 cM，标记间平均距离为10.7 cM的遗传图谱。Foolad等[8]以盐敏性番茄UCT5和耐盐性番茄LA716为研究材料，利用RAPD标记构建了包括53个RAPD标记的遗传图谱。Fulton等[9]基于LA925和LA716杂交获得的80株F2代群体建立了一张名为“Tomato-EXPEN2000”的遗传图谱，包括1 342个RFLP，1 070个CAPS，19个SNP和155个SSR标记，较好地覆盖了番茄的12条染色体。该图谱还包括基于ESTs数据库和拟南芥全基因组比较的COS标记，比较了番茄与拟南芥基因组的同线性关系。Liu等[10]采用SSR标记方法以栽培番茄XF98-7与野生醋栗番茄LA2184进行杂交，对一个单株的F3中选出143个单株构建了一张长度为808.4 cM，平均长度7.22 cM，含有112个标记的遗传图谱。

1.2 基于高通量测序技术的遗传图谱

随着高通量测序技术快速发展，在遗传图谱构建中充分展现了成本低、速度快、高通量、开发的标记分布广、密度大、多态性高等特点，以及2012年番茄‘Heinz 1706’基因组的数据公布，极大地促进了番茄在许多领域的研究发展。通过转录组测序、全基因组重测序、简化基因组测序等技术发掘分子标记为构建高密度遗传图谱提供了新思路、新方法[11]。

Sim等[12]以426份番茄材料通过转录组测序开发了8 784个SNP位点，并利用其构建了3个种间F2群体的高密度遗传图谱。Chen等[13]以番茄T3224(感病亲本)与L3708(抗病亲本)获得的F2∶3为作图群体，基于酶切简化基因组测序技术构建了包含440个多态性标记的遗传图谱，该图谱覆盖12个连锁群，标记平均间隔3.56 cM，并在L3708的2号染色体上鉴定出一个新的抗晚疫病QTL位点。Lin等[14，15]基于全球收集的360份番茄种质资源进行全基因组重测序，构建了完整的遗传变异图谱，揭示了番茄果实由小变大的两次进化历程、果皮颜色变异的关键位点和调控果实营养和风味物质的重要遗传位点，为番茄的基因挖掘和分子育种奠定了基础。

刘希艳[16]利用醋栗番茄(PI365967)和普通番茄(Moneymaker)为亲本构建含有211个株系的RIL群体，利用全基因组测序技术发掘到22 570个重组bin，选择其中的1 800个bin，采用绘图软件绘制了一个总长1 194.08 cM，平均图距0.66 cM，包含了12个连锁群的高密度遗传图谱。Gonda等[17]基于简化基因组测序技术对栽培品种NCEBR-1和野生番茄LA2093杂交获得的包含148个单株的RIL群体，构建了基于bin高分辨率遗传图谱。该图谱包含了在12条染色体上的2 869个bin，全长超过1 362 cM，标记间平均间隔距离仅为0.48 cM，并利用该图谱对RIL群体中两个果实品质性状(果实质量和番茄红素含量)的QTL进行了验证和优化。Wen等[18]以热敏感番茄LA1698和耐热番茄LA2093构建的200株F2群体进行绘制遗传图谱，该图谱全长1 503.82 cM，平均距离10.98 cM，包含12个连锁群的137个位点。

2 番茄重要性状基因定位研究

利用遗传图谱对一个或多个数量性状进行基因定位，可以快速、有效地确定控制该性状的基因位点在染色体上的具体位置及基因间的相互作用，为基因克隆奠定基础。

2.1 叶色相关性状基因定位

叶片是绿色植物积累有机物的场所，贯穿植株整个生命周期，对植株的生长发育具有不可或缺的作用，而叶片颜色的变化不仅决定地上部的外观，而且通过改变光吸收来影响光合效率，而光吸收反过来又可以影响作物的产量[19，20]。

目前，关于番茄叶色突变基因定位研究已有很多研究报道，宋丽华[21]通过构建近等基因系群体，利用CAPS和InDel标记对黄叶基因nv进行定位，nv基因被定位于9号染色体InD-09-4-1和HP63/64两标记之间，物理距离为51 Mb，并结合基因组重测序分析技术，筛选出12个候选基因。郭丽杰[22]发现一株杂色叶突变体，该突变体在30 d左右苗龄期开始逐步发生叶色变化，后期叶片出现部分白色斑驳，随着秧苗的生长具有白色斑驳的叶片增多，秧苗后期长势弱，直至死亡。通过普通栽培番茄与突变体构建F2代遗传分离群体，利用CAPS和InDel标记技术对突变体vg基因进行精细定位，鉴定出目的基因位于7号染色体上S6027和Ba6040两标记间128 kb的区域内。

2.2 果实相关性状基因定位

2.2.1果实质量与形态 番茄果实质量的变化，一直是众多学者研究的焦点。栽培番茄在很长一段时间内是通过野生番茄进化而来，并经历了从南美地区到世界各地区的复杂迁移模式。总的来说，栽培番茄的进化可以被认为有两个阶段：早期驯化阶段和后期改良阶段[23]。许多与番茄果实发育相关的遗传和分子机制已被阐明，并且通过基因定位方法鉴定出近30多个控制果实质量的QTL位点。然而，只有少数处于QTL位点内的基因被克隆，如fw2.2，fw3.2，fw11.3，lc，fas。在这些被克隆的基因中，fw2.2和fw3.2是调控细胞分裂的必需基因，fw11.3在调控细胞大小中起着重要作用，而fas和lc则是通过改变心室数目来调控果实大小的变化。

Illa-Berenguer等[24]利用QTL-seq对番茄果实质量变化的3个F2群体(12S139，12S141和12S143)进行QTL定位。共检测到3个控制果重的QTL位点(fw1.1，fw3.3，fw11.2)，其中fw11.2被精细定位到第11号染色体上的一个750 kb的区域内。该区域包含66个候选基因，编码一系列蛋白，如DNA-RNA结合蛋白、转录因子、酶和许多功能未知的蛋白质。Qi等[25]鉴定并克隆到一个新的控制番茄果实质量的基因(CSR)，该基因编码一个未知的蛋白，CSR发生变异后会导致番茄果皮细胞增大，果实质量增加，果肉丰满多汁。这项研究结果不仅揭示了番茄人工驯化的分子机制，还为番茄果实大小的遗传改良提供了新思路。Li等[26]采用全基因组关联法对288份番茄材料进行果实质量性状的关联分析，鉴定到GRAS2基因在调控果实质量性状中发挥关键作用。通过RNA干扰技术发现，GRAS2在番茄果实发育初期表达活跃，尤其在胚珠部位表现更为明显。而抑制GRAS2表达的转基因植株，则表现为果实发育受阻，果重降低、单果种子数目减少、花器官变小等性状，这为后续研究胚珠与果实发育的关系奠定了基础。

Fernando等[27]利用高通量测序和CRISPR/Cas9基因编辑方法，识别到一个决定番茄果实质量的基因开关(ENO)，它是一种调节花分生组织活性的AP2/ERF转录因子。遗传分析表明，在栽培番茄的驯化过程中，ENO与子房数(编码WUS)和束状(编码CLV3)基因座的突变具有协同效应，这两个基因座是果实质量进化的两个中心因子。在驯化过程中，ENO启动子的顺式调节突变是正向选择的靶点，为番茄果实质量的显著增加奠定了基础。

蔬菜的果实形态是作物多样化或改良过程中的另一个重要性状，它不仅能满足人们的好奇心，而且还可以区分不同作物品种。在番茄中，大而圆的果实在商场中很受欢迎，而细长或块状的果实则受到加工业的青睐。

迄今为止，已在番茄中确定出多个控制果实形状的基因，其中包括长果形、束状形和圆形等，果形主要受sun，ovate，sov1，fs8.1，fas和ovate等6个基因座所控制，而sun，ovate和sov1基因已经被克隆。

Xu等[28]认为SlCLV3(Solyc11g071380)基因是fas位点的基础，其突变被证明是由于在SlCLV3基因上游有一个294 kb片段发生倒位致使SlCLV3发生弱表达引起的。番茄CLV3基因编码拟南芥CLV3的一个同源基因，它可以与受体激酶CLV1结合。当CLV3与CLV1相结合，CLV1会抑制WUS的表达并减少细胞过度增殖；同时，WUS的表达可以促进CLV3的转录。因此，fas，CLV3的低表达导致WUS的过度表达，从而增加了子房数量，最终产生了一个束状的番茄果实。Sun等[29]对控制番茄果实细长形状的主要QTL-fs8.1进行精细定位，将fs8.1定位于第8号染色体长臂的3.03 Mb区间，并在fs8.1区域发现122个基因，其中存在6个差异表达基因。后期通过基因组序列分析，确定了12个候选基因作为fs8.1的基础。Wu等[30]通过克隆、蛋白互作和基因组编辑等技术，克隆到一个位于sov1基因座内的新基因—OFP20，并认为sov1可能是OFP20上游调控区发生31 kb缺失，致使该基因降低表达丰度，从而导致果实伸长。

2.2.2果实品质 随着社会经济发展水平的提高，消费者对果实品质特别是果实风味的要求日益提高，糖类和酸类物质在植物界中广泛存在，在品质形成方面发挥着重要作用。

王绍会[31]利用野生番茄(LA0317)和普通栽培番茄(9706)为亲本的后代群体BC2S7和BC2S8，对果实中可溶性固形物含量进行了定位分析。结果表明：在这两个群体中共被定位到9个QTL位点，可解释大约10%的表型变异率。其中qssc-9-1与Brix9-2-5的位置完全相符，同属于一个位点，并发现该基因来源于S.galapagense。赵建涛[32]以174份番茄种质为材料，对果实中含有的主要糖酸组成成分进行全基因组关联分析，共鉴定出139个显著关联位点，其中与柠檬酸显著关联的位点有38个；与苹果酸显著关联的位点共有5个；与脯氨酸显著关联的位点有4个；与葡萄糖酸显著关联的位点只有1个；与琥珀酸显著关联的位点有20个，对番茄的品质育种具有重要参考价值。

Ye等[33]基于代谢产物的全基因组关联、连锁图谱和基因功能研究相结合，定位到TFM6是调控番茄果实苹果酸积累的主要QTL，其编码一个铝激活苹果酸运转蛋白ALMT9，该基因位于细胞膜内。通过进一步研究表明，ALMT9启动子区的一个3-bp Indel与苹果酸含量完全连锁。而该Indel破坏了ALMT9启动子中的W-box元件结合位点，该位点阻止了WRKY转录抑制因子WRKY42的结合，从而减轻了ALMT9表达的抑制，促进了苹果酸的大量积累。此外，铝处理后，液泡膜局部ALMT9的表达丰度增加，从而提高苹果酸转运和增强对铝的抗性。此项研究首次揭示了ALMT基因在番茄品质形成和抗性方面的双重作用，ALMT9可能是番茄驯化和改良过程中的关键基因，为改善番茄风味品质和抗性方面的研究提供了基础，具有重要的科学意义。Wang等[34]通过3个樱桃番茄品种发现了SLMYB12基因的表达与黄酮醇的合成高度相关，通过转基因技术验证了SLMYB12基因发生超表达后，黄酮醇含量显著增加。因此，认为SLMYB12基因在樱桃番茄中黄酮醇的合成途径起着正向调控作用。

2.3 抗病相关性状基因定位

番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)属于DNA双生病毒，对许多重要作物造成严重危害。被其侵染后会导致叶片生长发育迟缓、异常，包括叶缘卷曲、叶面积缩小、叶片黄化脱落等[35]。目前关于TYLCV的抗性基因已经被报道，包括Ty-1，Ty-2，Ty-3，Ty-4和Ty-5。了解TYLCV及其相关种的发病机制，有助于制定新的防控措施，解决病毒入侵和传播的关键问题。

董淑芳[36]利用含有Ty-2基因的材料与易感材料构建了1 320株F2代分离群体，对Ty-2基因进行精细定位，并预测到了21个候选基因，其中Solyc11g069620.1含有NB-ARC类保守结构域，重点将Solyc11g069620.1作为Ty-2的候选基因。Wang等[37]基于高抗TYLCV材料(AVTO1227)和高感TYLCV材料(Money maker)构建F2和BC1群体用来评估抗病遗传机制，并鉴定到一个与SlNACI连锁的隐性抗病基因(Ty-5)。对子代的抗、感材料进行BSA定位，在4号染色体2.22-3.19 Mb区间定位到TYLCV抗病基因。利用定位区间标记将抗病基因进行进一步定位在Ty5-25～Ty5-29(14.5 kb)标记之间，且该区间只有1个pelota基因，因此将该基因作为Ty-5的候选基因。

番茄叶霉病是一种危害植株的叶、茎、果实的病害，由活体营养菌(Cladosporium fulvum，C.fulvum)引起的病害，在温室、大棚等保护地栽培时经常发生，严重威胁着番茄的生产。番茄的Cf系列基因(Cf-2，Cf-4，Cf-5，Cf-9，Cf-10，Cf-12和Cf-19)是一类重要的叶霉病抗性基因，可与C.fulvumAvr基因相匹配，激活防御基因的表达。Cf-19基因在1980年被定位在2号染色体的长臂上，之后对于该基因的研究一直处于停滞状态，严重影响了Cf-19基因在育种中的应用。Zhao等[38]利用含有Cf-19基因的抗叶霉病番茄品种CGN18423和易感病品种Money Maker分别构建F1，F2和F3群体，通过各世代群体进行抗病性鉴定，结果显示含有Cf-19的抗病材料的抗病性是由显性单基因所控制，遗传模式符合孟德尔遗传定律。通过SLAF-seq技术、基因功能注释、分子标记开发和表达模式验证等多种手段结合，将Cf-19基因定位1号染色体短臂的2.14 Mb区间内，获得了7个候选基因。根据荧光定量PCR分析结果，在全部7个候选基因中有2个Solyc01g005870.1.1和Solyc01g006550.2.1表现出与抗病应答过程相关的表达模式。其中，Solyc01g006550.2.1位于Cf-4/Cf-9基因位点之上，为Cf-10的等位基因。Lui等[39]根据F1，F2与BC1F1抗病与感病材料的表型证明番茄叶霉病菌抗性受显性单基因控制；通过对F2群体的抗/感病重测序，联合运用SNP-index与InDel-index的分析方法将Cf-10定位在Chr1上的3.29 Mb区间内。并利用在此区间开发的KASP标记进行精细定位，将Cf-10的定位区间缩短到790 kb，其中只有1个候选基因Solyc01g007130.3，此基因注释为1个含有LRR的受体蛋白激酶。最后通过RT-qPCR分析进一步验证Solyc01g007130.3为Cf-10候选基因，为克隆Cf-10基因奠定了坚实的基础。

2.4 其他农艺性状基因定位

Takisawa等[40]利用具有单性结实特性的番茄品种MPK-1与具有非单性结实的品种Micro-Tom构建了F4群体，对Pat-k基因进行精细定位。Pat-k被定位于1号染色体两个标记间的529 kb区域内，该区域包含60个候选基因。通过全基因组重测序和MPK-1基因组序列分析，确定了MPK-1中的SlAGL6基因是被一个反转座子插入而失活，从而造成番茄发生单性结实。田小琴[41]利用F2群体构建遗传图谱对番茄花序的间隔节位进行定位研究，共发现了2个QTL(qN1SU-1-1和qN1SU-1-2)位点，2者的遗传贡献率可解释45%的表型变异率。刘星雨[42]对番茄叶片夹角进行定位研究，研究表明：番茄叶片夹角性状是由2个主效QTL(LA1-1和LA1-2)位点所控制的，2者的遗传贡献率分别为18.7%和22.5%。并推测Solyc10g008620，Solyc10g008970，Solyc10g008990，Solyc10g009055可能是LA1-1的候选基因；Solyc10g054760可能是LA1-2的候选基因。Ye等[43]发现番茄茎秆的粗壮程度与果实大小之间存在显著相关性，基于GWAS和基因功能分析等方法定位到1个控制番茄茎粗的主效QTL(SDR9)，该位点编码1个激酶互作蛋白SD1。通过显微镜观察，SD1主要在茎秆的形成层部位表达，它通过调控次生韧皮部细胞的大小和数量来正向调控番茄茎秆发育。

3 展 望

自2012年番茄全基因组序列公开发表以来，已被用于筛选、鉴定与果实发育和成熟过程相关的候选基因、番茄序列的数据库和生物信息学研究，并作为其他茄科植物的参考基因组。随着高通量测序技术的快速发展，在全基因组水平上开发分子标记以构建高密度遗传图谱成为可能。为进一步推动番茄遗传图谱和基因定位的深入研究，建议在以下3方面加强工作：(1)构建更高密度和标记分布更均匀的遗传图谱，以满足番茄分子遗传研究的要求；(2)对番茄遗传育种上具有重要价值的性状基因进行深入研究，促进分子标记辅助育种的发展；(3)对现有的番茄遗传图谱进行整合，以提高番茄遗传图谱的通用性。通过构建高密度遗传图谱，对相关性状基因进行精细定位，促进分子标记辅助育种快速发展，加快育种进程。