非梗阻性无精子症患者睾丸穿刺获精子结局的预测因素研究

骆强翔，廖勇彬，黄昌平，郭江华，梁晓东

（江门市中心医院／中山大学附属江门医院生殖医学中心，江门 529000）

无精子症的人群发生率约为1%，占男性不育的10%～20%［1］。根据输精管道是否通畅可分为梗阻性（obstructive aszoospermia，OA）和非梗阻性（non－obstructive aszoospermia，NOA）两大类，后者约占60%［2］。睾丸活检病理学诊断是明确患者睾丸中精子发生状态的“金标准”。然而，有创操作不仅给患者造成痛苦，还可能对生精小管产生进行性、不可逆性的破坏和结构扭曲［3］。OA患者的睾丸生精功能正常或基本正常，可通过输精管道复通或经皮睾丸穿刺抽吸取精术（testicular sperm aspiration，TESA）获得精子，获精率几乎达100%；而NOA患者睾丸生精功能往往不同程度受损，文献报道穿刺获精率仅为20%～50%左右［2］。精准、无创的术前评估对提高TESA的获精率、减少不必要的手术创伤、减轻患者的心理负担意义重大。

睾丸体积间接的反应了睾丸内各级生精细胞、支持细胞的数量，精子的发生与成熟全过程则严格受控于下丘脑－垂体－睾丸轴的内分泌调节，有赖于FSH、LH、T等性激素的协调作用。血清抑制素B（inhibin B，INHB）是由睾丸支持细胞特异性分泌的一种糖蛋白，其合成过程大部分在生精细胞内完成，而后释放到血液，是直接反映睾丸生精细胞功能状态的血清学标志物。简言之，睾丸体积、血清INHB及性激素水平对NOA的病因、生精功能受损程度均有一定的提示作用，且具有无创性优点。本研究旨在探讨以上指标对预测NOA患者TESA获精子结局的意义。

资料与方法

一、研究对象

实验组为2017年3月至2019年3月在中山大学附属江门医院生殖医学中心男科门诊就诊的162例接受TESA的NOA患者，按手术获精子结局分为有精子组（TESA＋，n＝74）和无精子组（TESA－，n＝88）。入选标准：3次精液离心后镜检未见精子（3 000rpm，15min）；体格检查及辅助检查未见明确的输精管道梗阻征象。排除标准：外周血染色体异常；Y染色体AZF基因a段或b段缺失；明确的生殖道外伤、感染史，或伴随精索静脉曲张。

正常组为60例同期精液常规参数正常者。

二、研究方法

1．睾丸体积：由B超测得，记录穿刺侧体积：若两侧睾丸大小、质地相近，任选一侧穿刺；否则选择睾丸较大、质地较好的一侧穿刺。

2．血清INHB与性激素水平：患者晨起后7∶30～10∶00空腹在中山大学附属江门医院检验科抽血；INHB测定采用广州康润公司96TINHB定量检测试剂盒（酶联免疫法）；性激素（FSH、LH、E2、PRL、T）测定采用美国西门子公司ADVIA Centaur XP全自动化学发光分析仪并由其提供试剂盒；游离睾酮（fT）测定采用深圳新产业生物公司Maglumi 4000Plus全自动化学发光测定仪并由其提供试剂盒。

3．常规TESA：实验组患者取截石位，会阴部消毒、铺无菌巾，穿刺侧精索阻滞麻醉。使用30ml注射器沿睾丸横轴方向多个小角度反复进针3～4次，负压吸取约绿豆大睾丸组织分为两份：其中一份用1ml注射器针头充分撕碎后在400倍倒置显微镜下仔细寻找精子；另一份置于Bouin固定液中送病理检查。所有的手术由同一位男科医生完成，胚胎实验室显微镜检或睾丸组织病理学检查二者任一发现精子即入TESA＋组，否则入TESA－组。

三、统计学方法

采用SPSS 18．0及 MedCalc18．2．1统计软件处理，检验水准α＝0．05。多均数比较采用单因素方差分析，两两比较执行SNK检验和LSD检验（方差齐性）或Dunnett’s T3检验（方差不齐）；应用ROC曲线对存在显著性差异的指标进行优选，根据曲线下面积（Area Under Curve，AUC）来评价方法的优劣，应用Z统计检验AUC的两两差异性，并采用Youden指数法确定最佳切点值及对应的灵敏度和特异度。

结 果

一、各组间基础资料比较

1．一般资料：各组间年龄、不育年限、体重指数（BMI）整体比较均无统计学差异（P＞0．05）。

2．睾丸体积：TESA－组＜TESA＋组＜正常组，且组间比较有统计学差异（P＜0．05）。

3．INHB及性激素水平：TESA－组INHB水平显著低于TESA＋组和正常组（P＜0．05），而TESA＋组与正常组无统计学差异（P＞0．05）；TESA－组E2水平显著低于正常组（P＜0．05），其余组间比较无统计学差异（P＞0．05）；TESA－组FSH水平显著高于TESA＋组和正常组（P＜0．05），而TESA＋组与正常组无统计学差异（P＞0．05）；TESA－组、TESA＋组LH、PRL水平显著高于正常组（P＜0．05），而TESA－组与TESA＋组间无统计学差异（P＞0．05）（表1）。

由此可见，睾丸体积、INHB、FSH三项指标在TESA－组和TESA＋组间存在显著性差异，推断其对预测NOA患者TESA获精子结局可能有意义。

表1 各组基础资料比较（）

表1 各组基础资料比较（）

注：与TESA＋组比较，＃P＜0．05；与正常组比较，＊P＜0．05

组 别 例数 年龄 不育年限 BMI（kg／m2） 睾丸体积（ml） INHB（pg／ml）TESA－组 88 30．74±4．90 4．52±3．29 20．68±2．54 7．19±4．42＃＊ 52．04±60．58＃＊TESA＋组 74 29．68±4．25 5．26±3．52 20．74±2．85 12．30±3．13＊ 128．33±64．34正常组 60 30．42±4．59 4．75±3．32 20．87±2．63 15．98±3．13 136．18±40．48组 别 例数 LH（U／L） FSH（U／L） E2（pmol／L） PRL（nmol／L） T（nmol／L） fT（nmol／L）TESA－组 88 3．85±1．34＊ 11．65±8．46＃＊ 141．33±37．65＊ 0．36±0．23＊ 18．24±4．78 0．12±0．05 TESA＋组 74 4．12±1．27＊ 5．34±3．11 149．55±45．80 0．36±0．16＊ 17．09±6．00 0．11±0．05正常组 60 2．73±0．45 4．60±2．12 163．35±29．87 0．28±0．07 17．89±3．85 0．11±0．04

二、睾丸体积、血清INHB及FSH预测TESA获精子结局的ROC曲线

绘制睾丸体积、血清INHB及FSH预测TESA获精子结局的ROC曲线（图1、图2）。三者的ROC－AUC均大于0．7，表明以上指标对预测NOA患者TESA获精子结局有重要意义；三者的ROC－AUC由大至小排序为INHB＞睾丸体积＞FSH，应用MedCalc18．2．1统计软件进行两两比较发现，仅INHB与FSH的ROC－AUC有统计学差异（P＜0．05），表明INHB的预测意义大于FSH，而INHB、FSH分别与睾丸体积比较预测意义无统计学差异（P＞0．05）（表2）。

图2 血清FSH的ROC曲线

图1 睾丸体积及血清INHB的ROC曲线

表2 睾丸体积、血清INHB及FSH预测TESA获精子结局的灵敏度和特异度

讨 论

NOA的发生机制尚不明确，经TESA获精后ICSI助孕可使部分NOA患者获得拥有遗传学后代的机会，然而获精子结局并不确切。本研究采用常规TESA术式，结果显示NOA患者较高的血清INHB以及较低的FSH、较大的睾丸体积有利于TESA获精，且INHB的预测意义优于FSH。本研究结论与先前的一些研究相符：荟萃分析表明，根据睾丸体积和血清FSH水平可以预测睾丸生精功能是否存在障碍［4］；Madani等［5］认为，对于睾丸体积较小、FSH水平较高的NOA患者，盲目行TESA检查获精率极低；Bonarriba等［6］发现NOA患者较低的INHB相比较高的FSH更容易导致TESA获精失败。睾丸体积预示着其内部各级生精细胞的数量是否充足，而生精功能受下丘脑－垂体－睾丸轴的严格调控，下丘脑分泌GnRH作用于垂体前叶从而分泌FSH，后者作用于睾丸可促进精母细胞逐步发育为成熟精子。值得注意的是，成年男性血清INHB由睾丸支持细胞特异性分泌，与FSH相比它是反映睾丸曲细精管生精状态更加敏感的标志物，被认为是目前评价睾丸生精功能的最佳内分泌标志物［7］。

关于睾丸体积和血清FSH对NOA患者TESA获精子结局的预测意义孰优孰劣，目前尚存争议。部分学者认为睾丸体积的预测意义优于血清FSH［8－9］，而另一些研究则持相反的观点［10－12］。本研究认为，尽管从数值上看睾丸体积的ROC－AUC要略大于血清FSH，但这种差异并无统计学意义（P＞0．05），表明二者的预测意义并无明显的优劣之分。本研究中的患者睾丸体积全部采用B超测量计算所得，相比传统的睾丸体积测量器更具客观性和准确性，TESA未获精子组的睾丸体积平均为7．19ml，显著低于获得精子组的12．30ml和正常组的15．98ml，表明睾丸体积与TESA获精率呈正相关。国内相关研究［10，13－14］采用了与本研究相同的术式，得出睾丸体积的切点值为8．3～9．0ml，与本研究8．15ml的结论类似，表明睾丸体积对预测NOA患者常规TESA的获精率有良好的一致性与可靠性。Colpi等［15］总结138例NOA患者得出了与上述类似的结论，并认为在同等条件下 Micro－TESA的获精率较常规TESA高9．4%～11．1%。本研究相比Colpi等［15］更具针对性的Micro－TESA术式具有一定的随机性与盲目性，同等条件下一般认为获精率要低于后者，亦低于“金标准”睾丸活检术。

血清FSH水平可反映生精小管内各级生精细胞的分化和发育程度，高浓度的FSH往往预示着整个睾丸功能的损伤。研究表明，当血清FSH＞7．61U／L时，可出现生精功能受损；达到12．31U／L时，可出现生精功能低下；而当FSH＞17．63U／L时，TESA获精率显著降低［16－17］。本研究的FSH切点值为5．52U／L，较相关文献报道的8．20～13．31U／L［8－12］偏低，推测原因有三：（1）可能与血清FSH的分布特点有关。本单位血清FSH的参考值范围为1．4～18．1U／L，本研究正常组60例样本的FSH平均值为4．60U／L，第 25、50、75、95百分位数分别为3．14、4．27、5．33、9．10U／L，实验组162例样本的FSH 平均值为8．77U／L，第25、50、75、95百分位数分别为4．22、6．19、10．79、25．39U／L，表明这两组样本的FSH均呈明显的正偏态分布，即FSH在参考范围的左侧分布较多，从而导致FSH的切点值较低。（2）可能与手术方式的差异性有关。前述部分研究［8－11］采取了与本研究类似的常规 TESA术式，也有研究［12］采取的是睾丸活检。文献报道，高浓度的血清FSH可能影响不到部分含有精子较少的生精小管［18］，相比常规 TESA 而言，Micro－TESA术式或睾丸活检术可以使外科医生更大几率地在睾丸中发现这些生精小管，从而有望成功获取精子［19］。本研究相对较低的获精率可能导致FSH的切点值较低。（3）不同术式的研究结论差异较大，而即便是类似的术式，得出的结论亦差异较大，推测可能还与各研究者的样本量、入选标准以及术者经验均有一定的关系，同时一定程度上也反映出该指标具有不确定性。

目前，国内外关于血清INHB的相关研究尚为数不多，但多项研究认为血清INHB的预测意义优于血清 FSH［6，14，20－21］，与本研究结论 一致。睾丸支持细胞对生精细胞的分化成熟起着至关重要的机械支持、屏障保护与营养作用，成年男性血清INHB全部来自于睾丸支持细胞的分泌，具有高度的特异性。与FSH不同的是，它的血清浓度不受GnRH、雌／雄激素等因素的影响［7］，因此比FSH更能体现睾丸的生精状态。本研究血清INHB的切点值为70．15pg／ml，与 相 关 研 究 报 道 的 23．35pg／ml、40pg／ml有差异［14，22］，而与 Bonarriba等［6］报道的67pg／ml近似。前者采用睾丸活检术，睾丸活检病理学作为评判睾丸生精功能的 “金标准”，获精阳性率更高，故INHB的切点值可能比本研究所采取的常规TESA术式低；而后两者则是采用与本研究类似的常规TESA。研究结论有同有异，表明有待更大样本的、更多中心的研究或荟萃分析来充实或修正这一结论。另外，本研究发现，各指标的预测意义与其对应的灵敏度和特异度并不成正比（表2），表明单一的预测指标无绝对的优势性，联合诊断意义重大。

本研究NOA患者总例数仅为162例，较低的样本量可能降低本研究结论的可靠性，有待更长时间的临床实践以扩大样本量；其次，如前所述，本研究采取的常规TESA术式获精阳性率较Micro－TESA及“金标准”睾丸活检术偏低，具有一定的局限性，从而可导致结果偏倚，表现为FSH切点值可能偏低，而睾丸体积和INHB的切点值可能偏高。另据文献报道，睾丸组织的病理分型与NOA患者的精子获取率及ICSI受精率密切相关，其中精子发生低下型的精子获取率及ICSI受精率要明显高于精子成熟阻滞型和唯支持细胞型［23－24］。作为本研究的延伸，未来我们将在进一步丰富样本量的基础上，综合睾丸体积、血清INHB及FSH三项指标进行Logistic回归分析，根据预测概率描绘ROC曲线用于联合预测TESA获精率及睾丸病理类型，从而进一步指导临床工作。