用HPLC法测定人凝血酶制品中甘氨酸的含量

2020-01-19盛凤仙张幼捷上海新兴医药股份有限公司上海200135

药学实践杂志 2020年1期

盛凤仙，张幼捷（上海新兴医药股份有限公司，上海 200135）

人纤维蛋白黏合剂是上海新兴医药股份有限公司自助研发的新产品，是由人纤维蛋白原及其灭菌注射用水、人凝血酶及其灭菌氯化钙溶液4种成分组成，不含防腐剂和抗生素，具有止血、覆盖、黏合伤口等临床作用[1-2]。其中主要成分人凝血酶是由健康人的血浆经离子交换凝胶法分离纯化，并经S/D法和纳米膜过滤二步灭活和去除病毒、分装后冻干制成。由于冻干过程是一个复杂的相变过程，在冻结、冻融、干燥和储存过程中存在着多种影响因素，而冻干保护剂是影响制品冻干效果的主要因素，甘氨酸在冻干过程中对制品赋型作用显著，并对制品复溶后的澄清度有一定改善作用，是一种理想的蛋白保护剂[3-4]。公司在生产人血酶制品过程中加入适量甘氨酸作为蛋白保护剂，并且限定其含量为10～30 mg/ml。为了更好地控制产品的质量，有必要建立一种甘氨酸的含量检测方法用于人凝血酶制品的监控。笔者参考有关文献[5-8]，选用DNFB为柱前衍生剂，利用高效液相色谱法[7]，对人凝血酶制品中甘氨酸的含量测定方法进行探讨。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪：安捷伦1260高效液相色谱仪；DNFB（中国医药上海化学试剂公司，分析纯）；甘氨酸对照品（国药集团化学试剂公司，分析纯，含量≥99.5%）[7]；丙氨酸对照品（国药集团化学试剂公司，分析纯，含量≥99.0%，）[8]；乙腈（默克公司，色谱纯）；人凝血酶（上海新兴医药股份有限公司，批号：20150401T、20150402T、20150403T、20150504T；规格：1 000 IU/瓶）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 甘氨酸对照品溶液

精密称取甘氨酸对照品约60 mg，置100 ml容量瓶中，用纯化水定容，得浓度为0.6 mg/ml的甘氨酸对照品溶液[7]，等待衍生化处理。

2.1.2 供试品溶液

取一瓶待检人凝血酶供试品，放置于室温，用配套2 ml（40 mmol/L）氯化钙溶液溶解，然后轻轻摇动直至完全溶解；精密量取复溶后样品1.0 ml于试管中，加入4 ml 1.5%磺基水杨酸，混匀，离心，精密量取上清液0.5 ml，置10 ml容量瓶中，用纯化水定容，混匀后等待衍生化处理。

2.1.3 阴性对照溶液

精密量取无甘氨酸的人凝血酶样品溶液1.0 ml，按“2.1.2”项下供试品溶液制备方法操作，即得阴性对照溶液，等待衍生化处理。

2.1.4 内标溶液

精密称取丙氨酸约20 mg，置100 ml容量瓶中，用纯化水定容，得浓度为0.2 mg/ml的丙氨酸内标溶液，备用[7]。

2.2 衍生化反应

精密量取适量体积的甘氨酸对照品溶液或供试品溶液1.0 ml置10 ml容量瓶中，加0.5 ml内标溶液，再加0.5 mol/L碳酸氢钠（pH9.0）溶液1 ml，1%DNFB乙腈溶液0.1 ml，混匀，避光，置60 ℃恒温水浴中保温1 h后，取出放冷，用磷酸盐缓冲液（pH7.0）定容[7]，经0.22 μm水溶性膜过滤[8]，滤液备用。

2.3 色谱条件

色谱柱：岛津公司Shim-pack CLC-ODS（6.0 mm×150 mm,5 μm）；流动相：50%乙腈溶液-0.05 mol/L醋酸钠缓冲液（35∶65,）；流速1.0 ml/min；柱温：30 ℃；检测波长360 nm；进样量20 μl[7]。

2.4 专属性试验和系统适用性试验

精密量取上述制备的阴性对照溶液1.0 ml置10 ml容量瓶中，不加内标溶液，另外精密量取按“2.1.1”项下方法制备的对照品溶液0.4 ml、按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液1.0 ml，分别置10 ml容量瓶中，加0.5 ml内标溶液，按“2.2”项下方法进行衍生化反应，并按“2.3”色谱条件测定，记录色谱峰。结果在阴性对照溶液色谱图1A中仅有衍生化试剂DNFB色谱峰-1[7]；在甘氨酸对照品溶液色谱图1B和供试品溶液色谱图1C中，均有衍生化试剂DNFB色谱峰-1（保留时间约为9.9 min）、甘氨酸衍生物峰-2（保留时间约为12.6 min）和丙氨酸衍生物峰-3（保留时间约为19.3 min）3个峰，并且各峰之间完全分离，互不干扰[7]；在图1B中，甘氨酸衍生物与相邻两色谱峰的分离度分别为6.2和12.9，甘氨酸衍生物的拖尾因子为1.11，丙氨酸衍生物的拖尾因子为1.14，均符合《中国药典》要求，见图1。

2.5 线性关系考察

分别精密量取上述制备的甘氨酸对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 ml置10 ml容量瓶中，按“2.2”项下方法进行衍生化反应，并按“2.3”项下色谱条件测定，记录峰面积。以甘氨酸浓度（X，mg/ml）对甘氨酸衍生物峰面积与内标丙氨酸衍生物峰面积之比（Y）进行线性回归，得线性回归方程为Y=156.794 0X－0.127 2，r=0.999 6。结果表明甘氨酸浓度在0.006～0.030 mg/ml范围内与峰面积比呈良好线性关系[7]。

2.6 回收率试验

精密称取0.381 9、0.382 3、0.382 3、0.483 8、0.483 0、0.484 4、0.594 4、0.593 6、0.594 1 g甘氨酸对照品，分别置20 ml容量瓶中，用无甘氨酸的人凝血酶样品溶液定容，配制成19.10、19.12、19.12、24.19、24.15、24.22、29.72、29.68和29.71 mg/ml的甘氨酸对照品溶液，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2”项下方法进行衍生化反应，并按“2.3”色谱条件测定，记录峰面积。结果平均回收率为100.4%，平均RSD为0.44%，符合要求，详见表1。

表1 人凝血酶回收率试验结果（n=9）

2.7 精密度试验

精密量取上述制备的甘氨酸对照品溶液0.5 ml置10 ml容量瓶中，按“2.2”项下方法进行衍生化反应，并按“2.3”项下色谱条件测定，重复进样5次，记录峰面积。结果甘氨酸衍生物与丙氨酸衍生物峰面积比的RSD为0.19%，表明精密度良好[7]。

2.8 稳定性试验

精密量取按“2.1.2”项下方法配制的供试品溶液1.0 ml（批号：20150504T）置10 ml容量瓶中，按“2.2”项下方法进行衍生化反应，分别于0、4、12、13 h按“2.3”色谱条件测定，记录峰面积。结果显示，甘氨酸衍生物与丙氨酸衍生物峰面积比分别为3.960 3、3.960 9、3.961 0、3.961 0，RSD为0.01%，表明衍生化样品在13 h内稳定性良好。

2.9 重复性试验

取同一批（批号：20150504T）样品6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下方法进行衍生化反应，并按“2.3”色谱条件测定，记录峰面积。结果制品中甘氨酸含量分别为26.68、26.66、26.66、26.65、26.66、26.64 mg/ml，平均含量为26.66 mg/ml，RSD为0.05%（n=6），表明方法重复性良好[7]。