高浓度维生素B6注射液细菌内毒素检查方法学验证

沈 娟，芦佳月，罗晓茹，王习文（中国人民解放军联勤保障部队药品仪器监督检验总站，北京 100071）

维生素B6是一种水溶性维生素，遇光或碱易被破坏，不耐高温；是制造抗体和红细胞的必要物质[1]；对婴儿的大脑和神经系统发育亦至关重要[2]。可用于治疗因大量或长期服用异烟肼等引起的周围神经炎、失眠、不安；减轻抗癌药和放射治疗引起恶心、呕吐或妊娠呕吐等[3]；治疗或预防婴儿惊厥；治疗白细胞减少症、痤疮、酒糟鼻、脂溢性湿疹等[4-6]。注射用维生素B6其细菌内毒素检查已有报道[7]，维生素B6注射液质量标准也已被载入《中华人民共和国药典（二部）》2015年版[8]，其中包括了细菌内毒素检查项，但药典中该品种项下的药物浓度最高为50 mg/ml，而125 mg/ml高浓度维生素B6注射液其细菌内毒素的检查未见相关报道。为了更好地控制该注射剂的质量，笔者参照《中国药典》2015年版四部通则1143细菌内毒素检查凝胶法[8]，对维生素B6注射液用鲎试剂进行细菌内毒素检查的可行性研究。

1 试验材料

1.1 供试品

维生素B6注射液由军事科学院放射与辐射医学研究所提供（批号：1905131、1904261、1905132，规格20 ml：2.5 g）。

1.2 试剂

鲎试剂（福州新北生化工业有限公司，0.25 EU/ml，批号：19010812；0.06 EU/ml，批号：19050112；湛江安度斯生物有限公司，0.06 EU/ml，批号：1903132）；Tris缓冲液（湛江安度斯生物有限公司，批号：1904230；规格：每支4 ml）；镁离子缓冲液（湛江安度斯生物有限公司，批号：1901310；规格：每支4 ml）；细菌内毒素工作标准品（中国食品药品检定研究院，批号：150601-201886，规格：每支80 EU）；细菌内毒素检查用水（BET, bacterial endotoxin test水，中国食品药品检定研究院，批号：160006-201510；规格：每支5 ml）。

1.3 仪器

SSW-600-2S电热恒温水槽（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；其他器皿包括试管、微量移液器及无热原吸头。

2 方法与结果

2.1 限值的确定

本品为在研的维生素类制剂，其说明书用法用量为：“临用前以250 ml乳酸钠林格氏液稀释后静脉滴注。依病情，首次给予相当于维生素B61～5 g快速滴注。”得知本品的最大给药剂量为5 g/(60 kg·h)。根据公式L=K/M，K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂为5 EU/(kg·h)；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，则限值L=0.06 EU/mg。

2.2 鲎试剂灵敏度复核试验

按照《中国药典》2015年版四部通则1143[9]细菌内毒素检查法规定，对鲎试剂进行灵敏度(λc)复核。3批鲎试剂灵敏度测定值λc均在0.5～2.0 λ之间，均符合规定，3批鲎试剂灵敏度复核结果皆为标示灵敏度。详见表1。

表1 3批鲎试剂灵敏度复核结果

2.3 干扰试验预试验

2.3.1 维生素B6注射液最大有效稀释倍数（MVD）的计算

最大有效稀释倍数计算公式为：MVD=cL/λ，式中：L为供试品的细菌内毒素限值0.06 EU/mg；c为供试品溶液浓度；λ为鲎试剂标示灵敏度（EU/ml）。

根据市售鲎试剂灵敏度λ范围0.5～0.03 EU/ml，对维生素B6注射液进行细菌内毒素检测时，用0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 EU/ml的鲎试剂分别对应有效稀释倍数：15、30、60、120、240倍，分别对应有效稀释浓度：8.33、4.17、2.08、1.04、0.52 mg/ml。

由于供试品pH偏酸性（pH2～3），不在细菌内毒素测定的合适范围内，因此需先调节pH至6.0～8.0，再进行测定。前期试验发现，用0.25 EU/ml的鲎试剂，以0.1 mol/L氢氧化钠溶液作为pH调节剂进行内毒素试验，结果存在一定程度的干扰。

目前市售的pH缓冲液有湛江安度斯生物有限公司生产的镁离子缓冲液（pH6.5～7.5）和Tris缓冲液（pH6.5～7.5），拟用市售的缓冲液代替0.1 mol/L氢氧化钠溶液对供试品进行稀释和pH调节，再进行干扰试验。

2.3.2 试验操作及结果

用其中一批供试品（批号：1905132）进行细菌内毒素干扰预实验。将维生素B6注射液用镁离子缓冲液（以下简称“稀释剂Ⅰ”）分别稀释至8.33、4.17、2.08、1.04、0.52 mg/ml，此系列浓度溶液为不含内毒素的供试品溶液（NPC：negtive product control），另制备含有2λ（0.5 EU/ml）浓度细菌内毒素的相同系列浓度的供试液，此系列溶液为含内毒素的供试品溶液（PPC：positive product control）。

取灵敏度为0.25 EU/ml的鲎试剂，分别与NPC和PPC系列溶液反应，每一浓度设2支复管，同时设阳性对照（PC：positive control）、阴性对照（NC）、稀释剂Ⅰ阴性对照（ⅠNC）、稀释剂Ⅰ阳性对照（ⅠPC），结果见表2。

表2 维生素B6注射液用稀释剂Ⅰ稀释和pH调节后的干扰预试验结果

用Tris缓冲液（以下简称“稀释剂Ⅱ”）进行与稀释剂Ⅰ同样的干扰预试验，结果见表3。

表3 维生素B6注射液用稀释剂Ⅱ稀释和pH调节后的干扰预试验结果

结果表明：以稀释剂Ⅰ（或稀释剂Ⅱ）对供试品进行稀释和pH调节，供试品溶液浓度在1.04 mg/ml及以下对鲎试剂和内毒素的凝集反应无干扰。而1.04 mg/ml对应的鲎试剂灵敏度为0.06 EU/ml，故宜选用0.06 EU/ml及0.06 EU/ml以上灵敏度的鲎试剂进行细菌内毒素检查。

2.4 正式干扰试验

采用两个厂家生产的鲎试剂对3批维生素B6注射液(批号：1905131、1904261、1905132)进行正式干扰试验。试验选择灵敏度为0.06 EU/ml的鲎试剂进行，对应最小有效稀释浓度为1.04 mg/ml。用稀释剂Ⅰ和稀释剂Ⅱ分别对供试品进行稀释和pH调节，再进行干扰试验研究。

制备含有0.125（2 λ）、0.06（1 λ）、0.03（0.5 λ）和0.015（0.25 λ）EU/ml内毒素浓度的1.04 mg/ml的供试品溶液，每一浓度设4支复管；用BET水和稀释剂Ⅰ分别制备0.125（2 λ）、0.06（1 λ）、0.03（0.5 λ）和0.015（0.25 λ）EU/ml内毒素系列溶液，每一浓度设2支复管；并分别设NC 2支。与灵敏度为0.06 EU/ml的鲎试剂进行反应，按《中国药典》2015版四部通则1143细菌内毒素检查凝胶法[8]干扰试验规定进行试验，结果见表4。

表4 稀释剂Ⅰ稀释维生素B6注射液干扰试验结果

按照上述（用稀释剂Ⅰ稀释）方法，用稀释剂Ⅱ进行干扰试验，结果见表5。

由表4和表5可知：平行3批次干扰试验中阴性对照溶液NC、稀释剂对照溶液ⅠNC（或ⅡNC）、供试品溶液NPC的所有平行管均为阴性，两个厂家鲎试剂标示灵敏度对照系列的结果λc在0.5～2 λ之间（包括0.5 λ和2 λ），符合灵敏度复核要求，试验有效。两个厂家鲎试剂干扰试验系列的结果（Et）为0.5～2 λ（包括0.5 λ和2 λ），符合规定。表明供试品稀释至1.04 mg/ml时，采用0.06 EU/ml的鲎试剂进行试验无干扰，可用于细菌内毒素检查。

2.5 供试品细菌内毒素检查

取灵敏度为0.06 EU/ml的鲎试剂，按本研究建立的检查法用两个厂家的鲎试剂对3批维生素B6注射液进行细菌内毒素常规检查。维生素B6注射液用稀释剂I和稀释剂Ⅱ进行供试品稀释和pH调节后，细菌内毒素检查结果相同，皆符合规定。结果见表6。

表5 稀释剂Ⅱ稀释维生素B6注射液干扰试验结果

表6 维生素B6注射液细菌内毒素检查

3 讨论

《中国药典（二部）》2015年版收载的维生素B6注射液品种，内毒素的限值为每1 mg维生素B6中含内毒素的量应小于0.30 EU[8]。由于本供试品规格和浓度在《中国药典》2015年版中未涵盖，且由于本品说明书中的用量较大，根据说明书的用法用量及《注射剂安全性检查法应用指导原则》[9]，计算出本品内毒素的限值为：每1 mg维生素B6中含内毒素的量应小于0.06 EU，比药典规定的限值提出了更高的要求，试验中需要切实解决干扰问题。

经过一系列试验摸索，最终以市售的湛江安度斯生物有限公司生产的镁离子缓冲液（pH6.5～7.5）和Tris缓冲液（pH6.5～7.5）对供试品进行稀释和pH调节。经预实验可知，将供试品稀释120倍以下对凝胶法内毒素检查存在抑制性干扰，稀释120倍及以上对凝胶法内毒素检查无干扰，并通过正式干扰试验得到验证。试验结果表明：以pH6.5～7.5缓冲液稀释本品至1.04 mg/ml，用灵敏度为0.06 EU/ml鲎试剂对供试品进行细菌内毒素检查，方法可行。