葛根素对高糖介导成骨细胞中miRNA-142的影响研究

叶冰兵 童芬美 吴阿新

骨质疏松（osteoporosis，OP）是一种以低骨量和骨组织微结构破坏为特征，导致骨质脆性增加和易于骨折的全身性骨代谢性疾病。在糖尿病患者群体中，糖尿病骨质疏松导致的骨折具有高致残率，会对患有糖尿病的患者在医治和恢复方面产生更大的阻力。2型糖尿病患者因机体内的胰岛素数量不足，会提升骨基质胶原蛋白的分解以及钙的丢失，并降低骨密度［1］。葛根素（puerarin，Pur）是从豆科植物野葛根中提取分离出的一种异黄酮类化合物［2］，其结构为 8-β-D-葡萄吡喃糖-4'，7-二羟基异黄酮。Pur 有雌激素样活性［3］，被证明对多种骨质疏松症模型有效［4-5］，是防治骨质疏松的潜在药物。微小RNA（MicroRNA，miRNA）是真核生物含有的内源性、具有调控功能的非编码RNA，参与调控人体的多种功能。然而Pur 调控miRNA 治疗糖尿病骨质疏松的机制尚未阐明。本实验采用建立高糖介导的成骨细胞模型，运用生物信息学技术确定miRNA-142 的靶基因；采用RT-PCR 方法检测BMP2 表达；研究Pur 在miRNA 水平保护高糖介导成骨细胞的作用，促进糖尿病骨质疏松的中药应用研究。

1 材料与方法

1.1 动物与药品 新生24h 内的Wistar 大鼠［（5.0±0.5）g］购自浙江省医学科学院实验动物中心。生产许可证号：SCXK（浙）2014-0001，使用许可证号： SYXK（浙）2014-0008。Pur（宝鸡市辰光生物科技有限公司，纯度：98.0%）。

1.2 试剂与仪器 甲基噻唑基四盐（methyl thiazoly terazolium，MTT）（上海江莱生物科技有限公司），Trizol（Invitrogen），逆转录试剂盒（Thermo），miScript II RT Kit（QIAGEN），miRcute miRNA qPCR Detection Kit（SYBR Green）（TIANGEN），iScript cDNA synthesis kit（BIO-RAD），2X QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix（Qiagen），DMEM 培养基（Gibco），磷酸盐缓冲液（PBS）（Hyclone），低温离心机（eppendorf），定量PCR 仪：7900 HT Sequence Detection System（ABI），酶标仪（ANTAI）。

1.3 方法 （1）高糖介导的成骨细胞模型制备及给药：将4 只新生24h 内的Wistar 大鼠，引颈处死，自来水冲洗后放入75%酒精消毒10min。无菌操作取颅盖骨。将颅盖骨置于含PBS 液的培养皿中，尽量去除颅盖骨上的骨膜、血管及结缔组织，PBS 液反复洗涤至骨片发白。将骨片置于0.25%胰蛋白酶-EDTA 液中，用剪刀剪成1×1mm3的组织块。先后用0.25%胰蛋白酶-EDTA 液3 与0.1% II 型胶原酶37℃水浴消化。离心弃上清液，PBS 液重悬，离心弃上清液。用含15%胎牛血清的DMEM 培养液重悬，吹打均匀，接种至六孔板。37℃、5%CO2条件下培养，换液1 次/3d。待细胞长满后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA 液消化传代。葡萄糖溶液在实验前即以葡萄糖粉末和PBS 按计算好的比例配制，无菌过滤器过滤两遍，对照组加入等量PBS。以高浓度葡萄糖（33.1mmol/L）干预成骨细胞为模型（model）组；以低浓度葡萄糖（1.65mmol/L）干预成骨细胞为对照（control）组；Pur 组给予Pur（10μg/ml）。37℃、5%CO2条件下培养48h 后收集细胞进行后续实验。（2）噻唑蓝比色（MTT）法检测成骨细胞增殖情况：按照实验分组检测各组细胞增殖。取生长良好的第3 代成骨细胞，以2×104个/孔接种于96 孔培养板，200μl/孔，待细胞贴壁后吸弃培养液，按实验分组分别加入不同的培养基200μl，各组培养基均换液1 次/2d。于第7 天用MTT 法检测各组细胞增殖情况。MTT 法具体步骤：PBS 清洗细胞，在所需检测的培养孔加入无血清DMEM 培养液100μl/孔，再加入MTT（5mg/ml）20μl/孔，37℃，5%CO2浓度及饱和湿度的培养箱内孵育4h，小心吸弃孔内MTT 培养上清液，加入二甲基亚砜（DMSO）150μl/孔，振荡15min，在酶标仪中490nm，测定各孔的吸光度值并进行计算。（3）miRNA-142 的靶基因分析：运用MiRBase、TargetScan和BibiServ 软件，对miR-142 潜在的靶基因进行预测，筛选出较保守、结合自由能较低、匹配性较好，并且与骨损伤修复病理生理过程密切相关的作为靶基因。筛选的原则如下：①miRNA 种子序列与靶基因的配对情况：生物信息学预测miRNA 靶序列的主要指标是种子序列与靶序列连续互补配对。②RNA 的自由能：由于miRNA 与靶序列互补配对后，形成的双链二级结构自由能较低；故双链二级结构越稳定，说明miRNA 对靶序列的作用也越明显。③miRNA 靶序列的物种间保守性：序列在物种间的保守性与其功能密切相关，miRNA 在生物进化过程中相互作用的序列得以保留，因此其在参与生命活动中发挥重要的作用。根据上述原则，确定miRNA-142 的潜在靶基因为BMP2。（4）总RNA 提取及浓度测定：Trizol 法提取各组成骨细胞总RNA，转移裂解液，加三氯甲烷振荡，离心转移上清液加异丙醇混匀，离心后弃上清液，加DEPC 水配制的75%乙醇洗涤RNA；离心后弃上清液加DEPC 水充分溶解RNA。RNA 溶液稀释后行浓度测定，用紫外分光光度计测定RNA 样品在260nm 和280nm 处的OD 值，通过OD260/OD280 比值鉴定RNA 的质量和纯度，选择比值在1.8～2.0 之间的样品，计算其浓度。（5）RT-PCR 检测miRNA-142 和BMP2 mRNA 水平：按逆转录反应试剂盒说明书进行逆转录反应，反应产物进行PCR 扩增；PCR 过程按qPCR 试剂盒说明书在7900 HT Sequence Detection System 荧光定量PCR 仪上进行。检测各组成骨细胞中miRNA-142 和BMP2 mRNA 的表达量。结果以相对表达定量（RQ Relative Quantity）表示，RQ=2-△△CT。△△Ct=待测标本的△ct-对照标本△ct，△Ct=目的基因Ct 值-内对照Ct 值。以GAPDH 基因作为内参照基因。

1.4 统计学方法 采用SPSS19.0 统计软件。计量资料以（）表示，组间比较采用t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT 检测成骨细胞增殖情况 实验提示Pur 能提高糖介导的成骨细胞活性，促进增殖（P＜0.01）（见图1）。

2.2 预测miR-142 的潜在靶基因 生物信息学预测miRNA 靶序列，根据筛选原则，确定miRNA-142 的潜在靶基因为BMP2（见图2）。

2.3 成骨细胞RNA 样品分析 成骨细胞RNA 样品分析结果显示，A260/A280＞1.9，28S/18S 值均在1.6～1.7，证实提取的为高浓度的RNA。

2.4 RT-PCR 检测miR-142 和BMP2 mRNA 结果 Pur干预高糖介导的成骨细胞48h 后，各组细胞miR-142的表达水平（见图3）和BMP2 mRNA 的表达水平（见图4）：model 组miR-142 显著高于control 组（P＜0.05），BMP2 mRNA表达量显著低于control 组（P＜0.05）；Pur 组miR-142显著低于model 组（P＜0.05），BMP2 mRNA 表达量显著高于model 组（P＜0.05）。以上结果表明，Pur 能降低高糖介导的成骨细胞miR-142 水平，增加BMP2 mRNA 表达。

图1 MTT 结果图［1为正常成骨细胞；2为高糖（33.1mg/ml）介导的成骨细胞；3为低糖（1.65mg/ml）介导的成骨细胞；4为高糖（33.1mg/ml）介导同时给予Pur干预的成骨细胞。与1比较，＊P＜0.01；与2比较，#P＜0.01］

图2 miRNA-142的潜在靶基因为BMP2

图3 各组细胞中miR-142表达结果（与control组比较，＊P＜0.05；与model组比较，#P＜0.05）

图4 各组细胞中BMP2 mRNA表达结果（与control组比较，＊P＜0.05；与model组比较，#P＜0.05）

3 讨论

葛根作为传统中药，在我国多地均有种植，资源丰富，有解肌退热、透疹、生津止渴、升阳止泻之功［6-7］，在两千多年前就用作祛风解表药［8］，但近代发现Pur 与具有抗骨质疏松作用的大豆异黄酮在化学结构上相似，都属异黄酮类药物［9-10］，这就为中药葛根防治骨质疏松提供了理论可能。Pur 具有抗炎、抗氧化、抗骨质疏松、降糖、抗癌等多种功能活性。

骨愈合是机体在骨损伤后响应相关变化，维持骨结构稳态的复杂动态平衡，与成骨分化增殖、破骨吸收及内皮细胞功能有关，其进程受到多方面的调控［11］。BMP 是转化生长因子-β（Transforming Growth Factor，TGF-β）超家族的亚家族［12］，在修复骨损伤过程中发挥重要作用，其中BMP-2 是促进骨形成和诱导成骨细胞分化的重要细胞外信号分子，可通过作用于细胞膜上的Ⅰ型或Ⅱ型跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体复合物，激活Smads 通路和MAPK 通路［13］。

本实验研究结果表明：Pur 能提高糖介导的成骨细胞活性，促进增殖；生物信息学提示BMP2 是miR-142 的靶基因。与对照组比较，模型组miR-142 表达显著升高，BMP2 mRNA 表达水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，Pur 组miR-142 表达显著降低，BMP2 mRNA 表达水平显著升高（P＜0.05）。本实验研究发现miR-142 在高糖介导的成骨细胞中能调控BMP2 表达；而Pur 能下调miR-142 水平，增加BMP2 mRNA 表达。本次实验在miRNA 水平发现糖尿病骨质疏松的作用靶点，为临床糖尿病引起的骨质疏松防治新药的开发提供一定的理论基础。