长链非编码RNA OR3A4在非小细胞肺癌中的作用及其机制探讨

李珊珊 顾文超

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤，也是导致癌症死亡的主要原因。据估计，2018 年全球新增病例为2093876 例，死亡人数为1761007 人［1］。肺癌的主要组织学亚型是非小细胞肺癌（NSCLC），主要包括腺癌和鳞状细胞癌，约占肺癌的80%［2］。虽然近年来NSCLC 的临床治疗取得了越来越多的进展，但NSCLC患者的总体生存时间并未显著提高。因此，揭示非小细胞肺癌发生、发展的潜在分子机制，以开发新的非小细胞肺癌治疗策略具有重要意义。近年来，非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）因其丰富的调控手段在基因转录后调节中的作用越来越受到重视，其中长链非编码RNA（lncRNA），一类长度＞200 个核苷酸、编码能力有限的非编码转录产物，逐渐引起了人们的关注。研究发现lncRNA 在多种人类肿瘤中异常表达，在生物过程发挥重要作用，包括生长、细胞分化、增殖、凋亡和侵袭，发挥促癌或者抑癌基因的重要作用［3］。一些lncRNA 被报道在NSCLC 中具有致癌或抑制肿瘤的作用［4-5］。lncRNA OR3A4 是新近发现的一种lncRNA，在乳腺癌和胃癌中表达上调，促进癌症的发生发展［6］。然而，lncRNA OR3A4 在NSCLC 中的表达、作用及作用机制尚不清楚。本研究旨在探讨RNA OR3A4 在NSCLC 中的作用和机制，报道如下。

1 材料和方法

1.1 临床标本和伦理声明 在患者知情同意的情况下，经浦东新区人民医院伦理委员会按照国际标准批准，从浦东新区人民医院获得30 对NSCLC 组织及相邻非癌性肺组织样本。另外，10 例NSCLC 骨转移组织也取自浦东新区人民医院手术的NSCLC 患者。所有患者术前均未接受放疗或化疗。组织标本冷冻保存于- 80℃冷冻箱。

1.2 细胞培养和转染 人NSCLC 细胞株（A549、SPC-A1、H1299 和SK-MES-1）和HEK293T 细 胞 购自中国科学院细胞库（上海），PC-9 细胞和人支气管上皮（HBE）细胞购自ATCC（马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国）。用DMEM 或RPMI1640 培养基培养NSCLC 细胞株。使用Lipofectamine 2000 按照制造商的协议进行细胞转染。

1.3 qRT-PCR 分析 使用TRIzol®试剂从组织或细胞中提取总RNA。采用PrimeScript™RT 试剂试剂盒（TaKaRa，大连，中国）合成互补DNA，采用SYBR预混料Ex Taq II（TaKaRa）进行qRT-PCR 分析。β-actin作为标准化的对照。采用2-ΔΔCT方法计算相对基因表达水平。

1.4 Western blot 实验 用RIPA 缓冲液制备细胞裂解液。在10%凝胶上用SDS-PAGE 分离等量的蛋白质，并转移至聚偏氟乙烯膜上，然后用5%脱脂牛奶封闭1h。在4℃下用一级抗体将细胞膜培养过夜。使用的主要抗体如下：KLF6（Proteintech，武汉，中国）和β-actin（Proteintech）。将二抗37℃孵育1h 后，用增强的化学发光系统检测观察条带。

1.5 质粒构建和细胞转染 针对（shOR3A4）和阴性对照（shCtrl）的特异性shRNA 寡核苷酸购自上海吉玛制药技术有限公司。将编码OR3A4 的互补DNA 经PCR 扩增后插入pcDNA3.1（Invitrogen）中。细胞转染采用Lipofectamine 2000 进行。

1.6 细胞增殖检测 使用CCK-8 试剂盒评估细胞增殖能力。在96 孔板中每孔接种2000 个转染细胞，在不同时间点（接种后1d、2d、3d 和4d）检测细胞活力。在490nm 处用分光光度微平板阅读器测定吸光度。平板克隆形成实验：将转染后的细胞接种于6 孔板（1×103/孔）中，连续培养10d。更换培养基1 次/3d。实验结束时，用4%多聚甲醛固定细胞，结晶紫染色。在显微镜下计算细胞克隆数量。

1.7 细胞凋亡测定 采用Annexin V-Alexa Fluor 647/ PI 凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。转染细胞用胶原酶消化，收集细胞，用annexin V-Alexa Fluor 647 和PI在室温下染色15min。流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.8 细胞迁移实验 收集转染细胞，以每孔1×105个细胞的密度接种至上腔室。下室加入含有10% FBS 的500μl 细胞培养基。12h 后，用棉签取出细胞膜上表面的细胞。然后用甲醛固定下层细胞，用结晶紫染色30min。迁移细胞的数量在显微镜下计数。

1.9 细胞侵袭实验 将各室加入稀释后的基底基质凝胶37℃下聚合30min。转染细胞以2×105个细胞/孔的密度接种于上腔室。下室加入含有10% FBS 的500μl 细胞培养基。这些细胞被允许进入下膜24h。随后，用棉签取出细胞膜上表面的细胞。然后用甲醛固定下层细胞，用结晶紫染色30min。在显微镜下计数细胞迁移数。

1.10 体内实验 动物实验是在动物研究机构委员会的批准下进行的，严格按照美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南中的建议。雌性athymic BALB/c 小鼠（5 周龄）购自河南实验动物中心（郑州，中国），在特定的无致病性条件下培养。将稳定表达shCtrl 或shOR3A4 的A549 细胞（1×106）或稳定表达Ctrl 或OR3A4 的H1299 细胞（1×106）皮下注射于裸鼠侧翼两侧（n=6 只/组）。测量肿瘤体积1 次/5d，计算公式为体积=（长×宽×0.5）。25d 后小鼠被处死，并对肿瘤进行称重。

1.11 统计学分析 采用GraphPad Prism（Version 5.0，GraphPad Software，Inc）软件。计量资料以（）表示，组间比较采用t 检验或方差分析（one-way ANOVA）。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OR3A4 在NSCLC 细胞系和组织中表达上调 为了探讨OR3A4 在NSCLC 中的作用，采用qRT-PCR检测了30 对NSCLC 组织样本及相邻非癌性肺组织中OR3A4 的表达情况。OR3A4 在NSCLC 组织标本中的表达明显高于邻近非癌性肺组织标本（P＜0.05）（见图1A）。此外，作者收集了10 例NSCLC 骨转移组织，并测定了OR3A4 的表达。结果显示OR3A4 在骨转移组织中的表达高于原发性NSCLC 组织（P＜0.05）（见图1B）。此外，与HBE 细胞比较，OR3A4 在NSCLC 细胞 株（A549、SPC-A1、PC-9、SK-MES-1 和H1299）中的表达较高（P＜0.05）（见图1C）。

图1 OR3A4在NSCLC组织样本和细胞系中上调。A：OR3A4在30对NSCLC和非癌性肺组织样本中的表达的定量分析，与正常相比较，＊P＜0.05。B：OR3A4在30个原发性NSCLC组织和10个骨转移组织样本中的表达的定量分析，与原发性NSCLC比较，＊P＜0.05。C：定量OR3A4在NSCLC细胞系和正常HBE细胞中的表达，与HBE组比较，＊P＜0.05。

2.2 下调OR3A4 表达抑制NSCLC 细胞增殖、侵袭和迁移 为了研究OR3A4 在NSCLC 中的作用，使用shRNA 下调了OR3A4 在NSCLC 细胞中的表达。qRTPCR 验证了基因沉默的有效性（见图2A）。用CKK-8法和平板克隆形成实验测定了A549 细胞的增殖能力。结果表明，下调OR3A4 表达可显著抑制A549 细胞的增殖速率（见图2B）。菌落形成实验结果表明，与对照组比较，下调OR3A4 的A549 细胞形成的菌落明显减少（见图2C）。作者用流式细胞术测定了OR3A4的下调对A549 细胞凋亡的影响。如图2D 所示，在A549 细胞中，OR3A4 敲低显著增加了凋亡细胞的百分比。然后在体外评估了OR3A4 敲低对NSCLC 细胞转移潜能的影响。Transwell 迁移实验结果显示，与对照组比较，OR3A4 敲低组的细胞迁移更少（见图2E）。此外，基质凝胶侵入的结果实验表明，OR3A4 敲低也抑制了A549 细胞的侵袭能力（见图2F）。

图2 OR3A4敲低抑制NSCLC细胞的增殖、侵袭和迁移。A：qRT-PCR分析转染shCtrl 和shOR3A4的A549细胞中OR3A4的表达。B：采用CCK-8法测定shCtrl 和shOR3A4两组的细胞增殖能力。C：检测shCtrl 和shOR3A4两组的细胞克隆形成能力。D：流式细胞术分析shCtrl和shOR3A4转染的A549细胞的凋亡情况。E：采用Transwell迁移实验检测下调OR3A4表达后A549细胞的迁移能力。F：采用基质凝胶侵袭法对转染shOR3A4的 A549细胞进行侵袭性检测。与ShCtrl组比较，＊P＜0.05。

2.3 上调OR3A4 表达促进NSCLC 细胞增殖、侵袭和迁移 使用pcDNA3.0 上调了OR3A4 在NSCLC 细胞中的表达。qRT-PCR 验证了基因沉默的有效性（见图3A）。用CKK-8 法和平板克隆形成实验测定了H1299细胞的增殖能力。结果表明，上调OR3A4 表达可明显促进H1299 细胞的增殖速率（图3B）。菌落形成实验结果表明，与对照组比较，上调OR3A4 的H1299 细胞形成的菌落明显增加（见图3C）。作者用流式细胞术测定了OR3A4 的上调对H1299 细胞凋亡的影响。（如图3D）所示，在H1299 细胞中，OR3A4 过表达显著降低了凋亡细胞的百分比。然后在体外评估了OR3A4过表达对NSCLC 细胞转移潜能的影响。Transwell 迁移实验结果显示，与对照组比较，OR3A4 过表达组的细胞迁移增加（见图3E）。此外，基质凝胶侵入的结果实验表明，OR3A4 过表达也促进了H1299 细胞的侵袭能力（见图3F）。

2.4 下调OR3A4 表达抑制NSCLC 肿瘤生长，但上调其表达促进NSCLC 肿瘤生长 为进一步证实OR3A4在NSCLC 中的生物学作用，将稳定转染shCtrl 或shOR3A4 的A549 细胞，或稳定转染Ctrl 或OR3A4的H1299 细胞皮下注射到裸鼠体内。测量肿瘤体积1次/5d，并进行肿瘤注射25d 后称重。结果表明，与shCtrl 组比较，OR3A4 的下调显著抑制了体内肿瘤的生长，包括平均肿瘤体积（见图4A）和体重（见图4B）；OR3A4 的上调明显促进了体内肿瘤的生长，包括平均肿瘤体积（见图4C）和体重（见图4D）。

图3 OR3A4过表达促进NSCLC细胞的增殖、侵袭和迁移。A：qRT-PCR分析转染OR3A4过表达质粒以及空白质粒的H1299细胞中OR3A4的表达。B：采用CCK-8法测定Ctrl和OR3A4转染的H1299细胞的细胞增殖能力。C：检测Ctrl 和OR3A4两组的细胞克隆形成能力。D：流式细胞术分析Ctrl和OR3A4转染的H1299细胞的凋亡情况。E：采用Transwell迁移实验检测过表达OR3A4表达后H1299细胞的迁移能力。F：采用基质凝胶侵袭法对转染OR3A4过表达质粒的 H1299细胞进行侵袭性检测。与Ctrl组比较，＊P＜0.05。

图4 下调OR3A4抑制NSCLC肿瘤生长，上调OR3A4则促进NSCLC肿瘤生长。A：将稳定表达shCtrl或shOR3A4的A549细胞皮下注射于裸鼠，测量肿瘤体积1次/5d。B：肿瘤重量。C：将稳定表达Ctrl或OR3A4的H1299细胞皮下注射于裸鼠，测量肿瘤体积1次/5d。D：肿瘤重量。与Ctrl组比较，＊P＜0.05。

2.5 OR3A4 通过抑制KLF6 表达影响NSCLC 细胞生物学功能 已有报道OR3A4 通过抑制KLF6 促进卵巢癌的转移［7］。KLF6 在NSCLC 中具有抑癌作用［8］。因此，作者首次研究OR3A4 是否也调控NSCLC 中KLF6的表达，以及OR3A4 在NSCLC 中的致癌作用是否依赖于KLF6 的调控。采用qRT-PCR 和western blot 检测KLF6 在OR3A4 稳定过表达的H1299 细胞和OR3A4敲低的A549 细胞中的表达。结果显示KLF6 过表达下调了PXN mRNA 和蛋白水平，而敲低OR3A4 表达后上调PXN mRNA 和蛋白水平。另外，在OR3A4 过表达的H1299 细胞中转染KLF6 过表达载体明显抑制了OR3A4 对细胞增殖、侵袭和迁移的促进作用，而在shOR3A4 敲低的H1299 细胞中转染KLF6 敲低载体显著抑制了OR3A4 对细胞增殖的抑制作用。提示OR3A4 在NSCLC 中的促癌作用至少部分依赖于KLF6的负向调控。

3 讨论

在过去的十年中，各种lncRNA 被发现在癌症的发病机制中发挥着重要的作用［9-10］。在本研究中，作者发现OR3A4 在NSCLC 组织和细胞株中表达上调。OR3A4 过表达促进NSCLC 细胞增殖、迁移和侵袭，而下调OR3A4 表达则抑制NSCLC 细胞增殖、迁移侵袭和肿瘤生长。另外，进一步证明了OR3A4 在NSCLC 中的作用可能通过抑制KLF6 表达。结果表明OR3A4 在NSCLC 中发挥致癌作用。

本资料数据表明，OR3A4 的表达上调可能有助于NSCLC 的进展，这在其他癌症中也有类似的发现。Li等［11］证明OR3A4 通过调控AGGF1/akt/mTOR 通路参与肝细胞癌血管生成，证实OR3A4 是肝癌进展和血管生成的促进剂。在胃癌中，过表达OR3A4 促进胃癌细胞生长，血管生成和转移，并且证明了OR3A4 通过调节PDLIM2、MACC1、NTN4、GNB2L1 的活化，影响胃癌细胞的生物学功能［6］。OR3A4 在卵巢癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织。此外，OR3A4 基因在体外敲除后，细胞迁移和侵袭受到明显抑制［7］。此外，在乳腺癌中，OR3A4 在乳腺癌组织和细胞中表达上调，并与临床病理特征相关。下调OR3A4 表达通过影响细胞周期和凋亡抑制乳腺癌细胞的增殖，并通过EMT 抑制细胞转移，过表达OR3A4 取得相反实验结果。结果表明，OR3A4 是一种潜在的诊断生物标志物和治疗目标的各种癌症。

大量研究表明，KLF6 可以作为肿瘤抑制因子，调控增殖、迁移、分化、凋亡、细胞周期和血管生成等多种基本细胞功能，从而抑制肿瘤的发生［12］。KLF6通过下调间质标志物和抑制MMP-9 活性，抑制口腔癌的迁移和侵袭。KLF6 通过转录抑制E2F1 抑制透明细胞肾细胞癌的转移。Guo 等［7］指出OR3A4 通过抑制KLF6 促进卵巢癌的转移。另外有研究表明，KLF6在NSCLC 中表达下调，并通过诱导NSCLC 细胞凋亡抑制肿瘤生长，这可能提示KLF6 是NSCLC 的抑癌因子［8］。本研究中，在NSCLC 细胞中过表达OR3A4 显著降低KLF6 表达，而降低OR3A4 表达则明显促进KLF6 表达。另外结果证明NSCLC 细胞中转染KLF6可以显著减轻OR3A4 对NSCLC 细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。说明OR3A4 可能通过抑制KLF6 表达促进NSCLC 细胞增殖、侵袭和迁移。

综上所述，OR3A4 至少部分地通过KLF6 沉默促进NSCLC 细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究为OR3A4 在NSCLC 进展中的作用提供了新的证据，并为NSCLC 的诊断和治疗提供了一个潜在的标志物。