海南无乳链球菌的毒力基因与耐药特性分析

2020-01-17王爱媛郑立新蒲文渊曾纪锋郭桂英郑继平

水产科学 2020年1期

王爱媛，郑立新，蒲文渊，杨诺，曾纪锋，郭桂英，李迁，郑继平

( 1.海南大学生命科学与药学学院，海南海口 570228； 2.海南大学校医院，海南海口 570228； 3.海南大学教务处，海南海口 570228； 4.海南大学网络与教育技术中心，海南海口 570228 )

无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)属革兰氏阳性菌，会对人类和动物造成严重的侵入性感染。无乳链球菌不仅可引起人类脑膜炎、肺炎，新生儿败血症等，也会引起猪、牛、鱼等动物的链球菌病，这主要是因为该菌具有多种毒力因子，使其能够在宿主中定殖，逃避宿主吞噬从而大量繁殖[1]，具有较高的致病性和致死性。高晶等[2]发现，该菌对红霉素、左氧氟沙星、四环素、呋喃妥因等的耐药率呈逐年上升趋势，在健康妇女人群中带菌率高达15%～35%，这大大增加了新生儿染病的风险；无乳链球菌还通过引起奶牛乳房炎导致产奶下降，通过感染鱼类脑部、眼部、肝脏和脾脏等导致鱼类死亡，给奶牛养殖业和鱼类养殖业造成重大损失[3-4]。王蓓等[5]连续两年对华南地区患病莫桑比克罗非鱼(Oreochromismossambicus)进行采样，确认无乳链球菌是华南地区罗非鱼链球菌病的主要病原之一，证明无乳链球菌对水产养殖动物具有严重危害性。该菌毒力、耐药性复杂多变，受地区、环境等因素变化影响明显，为降低其危害，探明其致病机理，研究毒力因子，筛查其耐药性必不可少。

为更全面地了解无乳链球菌的特性，本实验室自海南地区的人、罗非鱼和奶牛源病料中分离到191株菌。经鉴定，其中18株为无乳链球菌。本研究内容主要是对18株无乳链球菌进行毒力基因和耐药基因的检测以及药物敏感性测定，对防治无乳链球菌病具有参考意义。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

脑心浸出液培养基为英国OXOID公司产品；抗菌药物药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒(Bacterial DNA Isolation Kit)购自北京华越洋生物科技有限公司；2×F8 Fast Long PCR Master mix，DL2000 DNA Marker均为北京艾德莱生物科技有限公司产品；琼脂糖为法国Biowest公司产品。

1.2 乳链球菌菌株

试验用4株人源无乳链球菌分离于海南大学校医院妇产科中患妇科疾病女性的阴道和肛门分泌物样品；14株罗非鱼源无乳链球菌，其中8株无乳链球菌分离于患病罗非鱼脑部，6株菌分离于眼部，发病罗非鱼样品来自海南省海口市澄迈罗非鱼养殖场以及海南大学东坡湖。

1.3 提取基因组

利用细菌基因组提取试剂盒对18株无乳链球菌基因组进行提取，通过NanoPhotometer仪器检测基因组的含量和纯度，然后保存于-20 ℃中。

1.4 毒力基因的检测

将得到的18株无乳链球菌分别进行14种毒力基因的检测，毒力基因引物参考文献[6-14](表1)。14种毒力基因分别为：黏附和毒力蛋白A基因(pavA)、C5α肽酶基因(scpB)、表面蛋白Rib基因(rib)、β-C蛋白基因(bac)、β-溶血素/溶细胞素基因(cylE)、α-C蛋白基因(bca)、CAMP因子基因(cfb)、层黏连蛋白结合蛋白基因(lmb)、透明质酸酶基因(hylB)、纤维蛋白结合蛋白A基因(fbsA)、细菌免疫原性黏附素基因(bibA)、冷休克蛋白A基因(cspA)、表面免疫原性蛋白基因(sip)、侵袭相关基因(iagA)。

1.5 耐药基因的检测

将得到的18株无乳链球菌分别进行13种耐药基因的检测，耐药基因引物参考文献[14-17](表2)。13种耐药基因分别为：磺胺类抗生素耐药基因sul1、sul2；氨基糖苷类药物耐药基因aacC2、aacC4；链霉素类药物耐药基因aadA；红霉素药物耐药基因ermA、ermB；氟喹诺酮类耐药基因gyrA、parC；四环素类药物耐药基因tetA、tetM；β-内酰胺类药物耐药基因pbp1A、pbp2B。

表1 无乳链球菌毒力基因引物Tab.1 Primers of virulence genes of S. agalactiae

表2 无乳链球菌耐药基因引物Tab.2 Primers of drug resistance genes of S. agalactiae

1.6 药敏试验

通过纸片扩散法(Kirby-Bauer法)对18株无乳链球菌进行药物敏感测定，通过产生的抑菌圈直径大小判定病原菌对药物的敏感性，根据美国临床和实验室药敏操作标准[18]可分为耐药、中度敏感和高度敏感。

2 结果

2.1 毒力基因的鉴定结果

将18株无乳链球菌分别进行14种毒力基因的PCR检测，发现人源和鱼源菌株中pavA、scpB、cylE、bca、cfb、hylB、fbsA、bibA、cspA、sip、iagA基因的发生频率均为100%。其中，人源菌株中未检测到bac基因，而鱼源菌株中检测率为100%；rib基因在人源菌株中检测率为100%，在鱼源中则为71.4%；lmb基因在人源菌株中阳性率为75%，鱼源中则为50%(表3)。

2.2 耐药基因的鉴定结果

将18株无乳链球菌分别进行13种耐药基因的PCR检测，发现人源和鱼源无乳链球菌中氟喹诺酮类耐药基因gyrA、parC以及β-内酰胺类耐药基因pbp1A、pbp2B阳性率均为100%；磺胺类耐药基因sul1、sul2阳性检出率为55.6%～72.2%，其中鱼源(64.3%～71.4%)的概率比人源(25%～75%)偏高；同样，链霉素类耐药基因aadA和红霉素类耐药基因ermA、ermB阳性率均较高，分别是83.3%和88.9%～100%，相比来看鱼源检出概率(78.6%～100%)比人源(50%～100%)高；而氨基糖苷类耐药基因aacC2、aacC4和四环素类耐药基因tetA、tetM在人源和鱼源病原菌中均未检测到(表4)。

表3 毒力基因鉴定结果 %Tab.3 Identification results of virulence genes

表4 耐药基因鉴定结果 %Tab.4 Identification results of drug resistance genes

2.3 药敏试验结果

本次药敏试验结果显示，分离得到的18株无乳链球菌对β-内酰胺类抗生素具有较高的耐药性，其中对青霉素G具有100%耐药率；同样，这些无乳链球菌对于大环内酯类抗生素(66.7%～83.3%)以及林可胺类抗生素(100%)的耐药率较高，其中人源菌株比鱼源菌株耐药率要高；相反，无乳链球菌菌株对于氨基糖苷类抗生素(61.1%～100%)、喹诺酮类抗生素(72.2%～100%)、四环素类抗生素(100%)以及复方新诺明(100%)、多黏菌素B(66.7%)则具有高度敏感性，总体上人源菌株比鱼源菌株敏感率高(表5)。

表5 无乳链球菌的药敏试验 %Tab.5 Drug susceptibility test of S. agalactiae

(续表5)

药品名称Drug药敏程度Drug sensitivity敏感Sensitivity中度敏感Medium sensitivity耐药Resistance氧氟沙星Ofloxacin人源Human100.0鱼源Tilapia71.477.80.028.622.20.00.00.0诺氟沙星Norfloxacin人源Human100.0鱼源Tilapia64.372.20.035.727.80.00.00.0林可霉素Lincomycin人源Human0.0鱼源Tilapia0.00.00.00.00.0100.0100.0100.0四环素Tetracycline人源Human100.0鱼源Tilapia100.0100.00.00.00.00.00.00.0复方新诺明Trimethoprim and sulphame-thoxazole人源Human100.0鱼源Tilapia100.0100.00.00.00.00.00.00.0多黏菌素BPolymyxin B人源Human75.0鱼源Tilapia64.366.725.021.422.20.014.311.1

3 讨论

3.1 无乳链球菌毒力基因检测分析

本次研究中，对18株无乳链球菌进行PCR检测毒力基因发现，人源和鱼源中pavA、scpB、cylE、bca、cfb、hylB、fbsA、bibA、cspA、sip、iagA基因的发生频率均为100%。其中β-C蛋白基因(bac)作用是与免疫球蛋白A结合，与免疫逃避有关，在人源菌株中阳性率为0%，而鱼源中却是100%。有研究报道[2,19]，在巴西、伊朗分离的人源菌株中测得bac基因阳性检出率分别为7.3%和4.9%。对比本次研究结果可知，bac基因可能并未在本次采集的人源病料的发病原中发挥作用。目前，已有研究发现[2,19-20]，在人源无乳链球菌中，hyl、scpB、bca等毒力基因阳性检测率均在76.8%以上；在鱼源无乳链球菌中，Kayansamruaj等[21]在泰国检测到cylE、hylB、bibA、fbsA 4种毒力基因阳性率为100%，但scpB和lmb基因阳性率仅为5%；Liu等[22]在巴西和洪都拉斯采集的鱼源无乳链球菌中检测到cylE、bca基因阳性率高达50%。而在本次试验中十几种重要毒力因子阳性检出率高达100%，且人源和鱼源菌株中个别毒力因子携带率不同，已有研究鲜有报道。本次研究中的分离菌株均携带有多种毒力因子，其存在无疑会增强病原菌毒力，此次结果对于无乳链球菌的研究具有一定的参考意义。

3.2 无乳链球菌耐药特性分析

将耐药基因鉴定结果和药物敏感性的筛查结果比较，发现总体上耐药基因检出概率高，则对应药敏检测的耐药率偏高；耐药基因检出率低，则药敏检测的敏感率偏高。但从个体菌株进行比对，发现并不是严格对应的，例如β-内酰胺类耐药基因阳性率为100%，但对应的头孢氨苄抗生素耐药率仅为50.0%，并非全部耐药。这可能与机体内复杂的作用机制有关，一些耐药基因存在但不一定被表达。目前大多研究推荐青霉素等β-内酰胺类药物作为治疗无乳链球菌的一线药物，在国内的北京、上海、武汉等地区[23-24]还有国外的伊朗[2]、美国[25]、葡萄牙[26]等地，都普遍发现人源无乳链球菌对青霉素敏感。但随着抗生素的大量使用，已有研究者发现青霉素耐药菌株[27-28]。本次分离得到的无乳链球菌对β-内酰胺类抗生素耐药率较高，相比鱼源菌株比人源菌株的耐药率还要高；而红霉素作为二线药物，有研究[24-25]发现，近年来耐药率逐渐上升，本次研究得到的红霉素耐药率高达66.7%，这与已有的研究结果一致。耐药情况的出现可能与临床药物的滥用从而导致机体产生不同程度的耐药性有关，因此，临床应加强对无乳链球菌的流行病学及耐药情况监测，选择合理有效的抗菌药物。