栅藻B38营养成分分析及蛋白质营养价值评价

2020-01-17王盛林刘平怀潘孝妍王秀海

水产科学 2020年1期

曹猛，王盛林，刘平怀，潘孝妍，王秀海

( 海南大学化学工程与技术学院，海南海口 570228 )

栅藻[Scenedesmus(Desmodesmus)armatus]作为微藻中的一类，又称栅列藻，属绿藻门、绿球藻目、栅藻科、栅藻属。细胞常为椭圆形或纺锤形，以长轴排成1～2列或多列。细胞壁薄、光滑，或有颗粒、细齿、隆起线和刺等特殊构造[1]。栅藻中含有类胡萝卜素、不饱和脂肪酸等功能性物质[2]，为对环境污染耐受性较高的微藻。在适合的培养条件下还可获得生物柴油、蛋白质等高附加值产品。栅藻是研究水体污染的一种很好的试验材料，是有机污水氧化塘生物相中的优势种类。栅藻进行光合作用时，一方面产生氧气供细菌分解有机质的需要，另一方面还可直接利用有机质作为碳源和氮源，使水中有机物迅速降解，从而净化水体[3]。针对栅藻的研究，目前主要集中于栅藻生长条件[4-6]、基因工程[7]及应用方面。凌善锋等[8]考察了用紫外辐射和亚硝基胍复合胁迫的方法培育产虾青素的斜生栅藻(S.obliguus)藻种，用于动物饲料的开发利用。Ho等[9]利用分离得到的7株斜生栅藻处理污水，氮去除效果显著，去除率超过70%。在栅藻蛋白质方面，目前的研究主要在蛋白质的提取工艺[10-11]，包括液氮研磨破碎细胞法和超声细胞破碎法等，而对栅藻蛋白质营养价值评价的研究较少。本研究对栅藻B38进行全营养素分析，通过必需氨基酸指数、必需氨基酸比值、氨基酸比值系数、比值系数分、贴合度等进行蛋白质营养价值评价，为该藻的综合利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

试验所用藻种由海南热带淡水区域分离所得的栅藻B38。

1.1.2 仪器设备

TU-1810紫外—可见分光光度计(北京普析有限责任公司)、TDL-5型离心机(常州中捷有限公司)、X0-5200DTD型超声清洗仪(南京先欧有限公司)、HP6890型气相色谱—质谱联用仪(美国惠普公司)、Waters 2695型液相色谱仪(美国Waters公司)、X7型电感耦合等离子体质谱仪(美国热电公司)、A320型电子顺磁共振波谱仪(德国布鲁克公司)

1.2 试验方法

1.2.1 基本营养成分测定

分别参照测定栅藻中蛋白质[12]、油脂[13]、灰分[14]、粗纤维[15]、水分[16]和总糖[17-18]的含量。

1.2.2 脂肪酸分析

样品前处理参照文献[19]的方法并加以改进，取藻粉0.5 g，加入0.5 mol/L的氢氧化钠—甲醇溶液5 mL，振荡混合10 min后加入1%硫酸—甲醇溶液8 mL，振荡混合10 min，再依次加入2 mL水和3 mL正己烷，离心收集上层溶液，重复萃取3～5次，合并上层溶液，待溶液挥发浓缩至约1 mL用0.22 μm微孔滤膜过滤，置于气相色谱样品管中，封口待测。

气相条件：色谱柱Agilent HP-5MS 5% Phenyl Methyl Silox 0～325 ℃(325 ℃),30 m×250 μm×0.25 μm,进样口温度,280 ℃；载气,He；柱流量,2.25 mL/min；分流比，20∶1。质谱条件，EI源；电离电压，70 ev；离子源温度，230 ℃；扫描范围，10～500 amu；进样量，1.0 μL。

1.2.3 氨基酸分析

1.2.3.1 样品处理与测定

称取试验所用栅藻样品2 g，向其中添加20 mL磺基水杨酸(10%)，用超声波细胞破碎仪低温下超声处理后，4 ℃静置15～17 h，5000 r/min离心10 min，取上清液，调整pH值至6.0，并用超纯水定容至50 mL，取2 mL滤液用0.22 μm微孔滤膜过滤，置于样品管中备用[19]。

色谱条件：色谱柱Agilent100 C18，4.0×125 mm；柱温，40 ℃；流速，1.0 mL/min；波长，338 nm，262 nm；流动相A，20 mmol醋酸钠液；流动相B，20 mmol醋酸钠液∶甲醇∶乙腈=1∶2∶2(体积比)。

1.2.3.2 营养价值评价

将样品中的必需氨基酸分别与联合国粮农组织/世界卫生组织必需氨基酸模式[20]和全鸡蛋蛋白模式[21]进行比较，按下式计算藻株中的必需氨基酸指数(EAAI)[22]、必需氨基酸比值(AAS)[23-24]、氨基酸比值系数(RC)[25]、比值系数分(SRC)[26]、贴合度[27]。

(1)必需氨基酸指数

式中，EAAI为必需氨基酸指数，uk为样品中第k种必需氨基酸含量，Ak为鸡蛋蛋白中相应的第k种必需氨基酸含量。

(2)氨基酸比值

式中，AASk为氨基酸比值(1≤k≤8)，uk为样品中对应的第k种必需氨基酸含量，ak为标准蛋白模式的第k种必需氨基酸含量。

该比值的意义是一定量食物中的氨基酸含量，相当于模式氨基酸的多少倍。由于各氨基酸的比值不会相同，因此可计算各氨基酸比值之均数，表示食物中氮基酸含量是模式氨基酸的多少倍。

(3)氨基酸比值系数

式中，RCk为氨基酸比值系数(1≤k≤8)，AASk为样品中第k种必需氨基酸的氨基酸比值，AAS为样品中必需氨基酸比值的平均值。

(4)比值系数分

SRC=100-RSD×100

式中，SRC为待测物质的氨基酸比值系数分，RSD为待测物质RC的相对标准差。

(5)贴近度：待评价物质的氨基酸品质与模式蛋白的接近程度，其值越接近1，反映物质的蛋白质营养价值越高。

式中，Uk(a,u)为贴近度(1≤k≤8)，ak为标准蛋白模式的第k种必需氨基酸含量，uk为样品中对应的第k种必需氨基酸含量。

1.2.4 微量元素及重金属测定

称取样品0.2 g干燥后的藻粉于消解内罐中，加入5 mL硝酸和2 mL过氧化氢，盖好内盖，放置1 h，旋紧不锈钢外套，放入恒温干燥箱120 ℃消解2 h后160 ℃继续消解4 h，在箱内自然冷却至室温，然后缓慢旋松不锈钢外套，将消解内罐取出，用少量水冲洗内盖，超声脱气2～5 min去除棕色气体。将消化液转移至25 mL容量瓶中，并定容至刻度，取2 mL用0.22 μm微孔滤膜过滤待测，同时作试剂空白试验。

采用电感耦合等离子质谱的方法，对栅藻B38中铜、锂、镁、锰、锌、钙等30种微量元素进行定量分析。工作参数见表1。

1.2.5 维生素的测定

分别参照国家标准测定栅藻中的维生素A、E[28]，维生素B1[29]，维生素B2[30]，维生素B3[31]，维生素B6[32]，维生素B12[33]，维生素C[34]的含量。

2 结果与分析

2.1 栅藻的一般营养成分

试验所用栅藻B38的能量为1579.59 kJ(表2)，除低于大豆1632.15 kJ的能量外，均高于表2中所列出的其他几种食物，其中包括多种藻类物质，如螺旋藻(Spirulinasp.)能量为1536.73 kJ，胶网藻(Dictyosphaeriumsp.)能量为1552.64 kJ，而裙带菜能量仅为838.38 kJ。栅藻B38蛋白质含量为49.0%，除低于螺旋藻蛋白质含量(69.30%)外，显著高于小麦粉(11.2%)、鸡蛋(13.3%)，且比作为高蛋白质食物的大豆(35.0%)高出14%的含量，此外比同属藻类的苔菜(Enteromorphaprolifera)(19.0%)蛋白质含量高出30%，高于胶网藻(18.55%)和裙带菜(Undariapinnatifida)(16.0%)约30%。栅藻B38藻粉中油脂含量(14%)接近大豆中含量(16.0%)，高于螺旋藻(5.36%)，总糖含量(13.86%)高于螺旋藻(10.44%)。其粗纤维(3.52%)相比于胶网藻(12.31%)、裙带菜(9.0%)、大豆(15.5%)、苔菜(干)(9.1%)较低，灰分(4.28%)也明显低于胶网藻(12.43%)、裙带菜(29.9%)、苔菜(干)(30.6%)，但接近与螺旋藻中的灰分含量(4.20%)。

表1 ICP-MS工作参数Tab.1 Operating parameters of ICP-MS

2.2 栅藻脂肪酸组成及其含量

栅藻B38含有脂肪酸种类多达23种，多不饱和脂肪酸含量占47.57%(表3)。其中十六碳的不饱和脂肪酸较多，且十六碳三烯酸(18.77%)占总不饱和脂肪酸的39.46%。此外，十六碳二烯酸(7.61%)、十六碳三烯酸(18.77%)、十六碳四烯酸(7.99%)和亚油酸含量(12.45%)占比较高，棕榈酸占比为36.14%。

2.3 氨基酸测定

栅藻B38氨基酸总量为852.58 mg/g(每克蛋白质中氨基酸的毫克数)，必需氨基酸总量(404.51 mg/g)占总氨基酸的47.45%(表4)，其中苏氨酸和亮氨酸相对含量较高，分别为75.51 mg/g和63.06 mg/g。非必需氨基酸总量(448.07 mg/g)占比52.55%，其中谷氨酸含量(143.27 mg/g)最高，组氨酸含量(21.73 mg/g)最低。鲜味氨基酸(195.31 mg/g)占比22.91%。必需氨基酸指数为85.42%。

表2 栅藻B38与其他食物的一般营养成分含量(以每100 g可食部计算)Tab.2 Approximate nutrient content of B38 and other foods (per 100 g edible portion calculated)

注：*.数据来自文献[19，35]；—.表示未检出或含量很少.

Note: *.data are derived from the reference [19,35]; —.no detectable or very low content.

表3 栅藻B38脂肪酸组成及含量 %Tab.3 Fatty acid composition and content of B38

注：—.未检出或含量很少;*.单不饱和脂肪酸；#.多不饱和脂肪酸.

Note: —.undetected or low content; *.monounsaturated fatty acids; #.polyunsaturated fatty acids.

表4 栅藻B38的氨基酸组成及含量 mg/gTab.4 Amino acid composition and content of B38

注：*.必需氨基酸；#.鲜味氨基酸.

Note: *.essential amino acids; #.flavor amino acids.

联合国粮农组织/世界卫生组织模式的氨基酸比值中，除苏氨酸(1.89)和色氨酸(2.06)较高外，其余值均在1附近；氨基酸比值系数为0.72～1.64，其中苏氨酸和色氨酸大于1，表明此两种必需氨基酸相对过剩(表5)。此模式下比值系数分为65.68，贴合度为0.93。全鸡蛋蛋白模式氨基酸比值中，除苏氨酸(1.61)和色氨酸(1.21)大于1外，其他的值均在0.70附近。氨基酸比值系数为0.75～1.75，相对于联合国粮农组织/世界卫生组织模式波动较大，此模式下比值系数分为65.13，贴合度为0.88。

2.4 微量元素及重金属测定

矿物质元素是构成机体组织的重要成分，具有维持机体的酸碱平衡及组织细胞渗透压等作用。由表6可见，从栅藻中共检测出23种矿物质元素，其中钠、钾、钙、镁、铁、铝含量较为丰富，分别为4582.500、4552.833、4549.416、2514.049、560.583、475.283 mg/kg。重金属铅、镉、汞、砷、锡、镍、铬的含量分别为0.682、0.047、0.021、0.080、1.619、0.840、0.420 mg/kg，均处于食品安全国家标准的安全范围[36]。

表5 必需氨基酸比值、氨基酸比值系数、比值系数分及贴合度的计算Tab.5 Comparison of AAS, RC and SRC of essential amino acids and calculation of fit degree

表6 栅藻B38矿物质元素种类及含量 mg/kgTab.6 Kind and content of mineral elements in B38

注：—.未检出或含量很少,下同.

Note: —.undetected or low content，et sequentia.

2.5 栅藻中的维生素

由表7可见，栅藻B38中含有水溶性维生素B2、B3和脂溶性维生素E，且其中维生素B3(106.02 mg/100 g)和维生素E(540.77 mg/100 g)的量较高。

3 讨论

3.1 一般营养成分

栅藻B38含油脂较少，而蛋白质(49.0%)含量较高，其蛋白质含量相较于樊星等[10]提取油脂后藻渣中的蛋白质含量(41.05%)高出约8%。本研究中所测得的蛋白质含量为所收获的藻粉原样，而在Yang等[37]的研究中所用的栅藻为提取油脂后的藻渣，其蛋白质含量为32.4%，栅藻B38高出其约17%，可见栅藻B38蛋白含量丰富，更具开发价值。蛋白质作为维持养殖对象生长和生命活动的主要功能性物质[38]，在动物养殖方面需求较大。在水产养殖方面作为蛋白质重要来源的鱼粉，其也制约着水产养殖业发展，减少对其的使用可降低饲料成本。栅藻B38作为蛋白质含量丰富的藻株，可考虑将进一步开发作为饲料蛋白源使用。陈晓清等[39]研究发现，所用两种藻的蛋白质与多糖提取物可不同程度地抑制细菌和真菌活性，且其中蛋白质提取物对真菌的抑制作用大于对细菌的抑制作用。本研究只针对其各种基本营养素含量做了测定，由于其蛋白质含量较高，可对其生物活性等作进一步研究，开发其利用价值。

表7 栅藻B38维生素含量 mg/100 gTab.7 Vitamin content of B38

3.2 脂肪酸组成及其含量

栅藻的脂肪酸组成中，23种不饱和脂肪酸含量占49.28%，其中单不饱和脂肪酸占总体脂肪酸的1.71%，多不饱和脂肪酸占总体的47.57%，由此可以看出其不饱和脂肪酸丰富。在脂肪酸中，亚油酸含量(12.45%)较高，其在降低胆固醇方面有重要的作用，它通过影响磷脂酰胆碱的重建来降低胆固醇的含量[40]。此外有研究表明，一定含量的亚油酸可促进肝星状细胞增殖[41]。

3.3 氨基酸组成及评价

组成蛋白质的氨基酸中，必需氨基酸的量与食物营养价值关系密切相关，其与人体必需氨基酸的组成比例接近程度决定其被吸收利用程度，因此其营养方面的价值更凸显[42-43]。栅藻B38中氨基酸总含量为852.58 mg/g，其中必需氨基酸占氨基酸总量的47.45%，必需氨基酸与非必需氨基酸之比为90.28%，显著高于萱藻(Scytosiphonlomentaria)(必需氨基酸占氨基酸总量的36.11%，必需氨基酸与非必需氨基酸之比56.51%)、囊藻(Colpomeniasinuosa)(必需氨基酸占氨基酸总量的37.18%，必需氨基酸与非必需氨基酸之比59.20%)、江蓠(Gracilaria)(必需氨基酸占氨基酸总量的39.06%，必需氨基酸与非必需氨基酸之比64.11%)、叉枝藻(Ahnfeltiopsisparadoxa)(必需氨基酸占氨基酸总量的34.11%，必需氨基酸与非必需氨基酸之比51.74%)[44]。联合国粮农组织/世界卫生组织提出的理想蛋白质条件：必需氨基酸总量与氨基酸总量之比为40%，必需氨基酸总量与非必需氨基酸总量之比为60%[45]。由此可见，栅藻符合标准。其中必需氨基酸与非必需氨基酸总量之比远远大于参考值，说明栅藻B38营养价值高。栅藻B38中鲜味氨基酸的含量为22.91%，说明试验所用微藻味道鲜美。作为鲜味氨基酸，有研究表明，谷氨酸可经一些途径转化为其他物质，在缓解应激方面具有较大的作用[46]，而天冬氨酸可以改善肠道结构和功能[47]。必需氨基酸指数为85.42%。根据胡国宏等[48]利用必需氨基酸指数评价饲料原料的标准：必需氨基酸指数≥90%的为优质蛋白源，必需氨基酸指数在80%～90%的为良好蛋白源，必需氨基酸指数在70%～80%的为可用蛋白源，必需氨基酸指数<70%的为不适蛋白源。由此可见，本研究饲料中所用的微藻是一种良好的蛋白源。在与联合国粮农组织/世界卫生组织模式和全鸡蛋蛋白模式比较时发现，两种模式下的第一限制性氨基酸分别为亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。两种模式的比值系数分较接近，均在65以上；待评价物质的氨基酸品质与模式蛋白贴近度接近1，尤其是联合国粮农组织/世界卫生组织模式，反映物质的蛋白质营养价值较高。

3.4 微量元素及重金属含量

矿物质元素是构成机体组织的重要成分，具有维持机体的酸碱平衡及组织细胞渗透压等作用。本研究所用栅藻共检测出23种矿物质元素，其中钠、钾、钙、镁、铁、铝含量为475～4600 mg/kg，而这些元素在动植物生长过程中起着重要的作用，饲料中钙的含量会影响对其他矿物质的吸收[49]，而饲料中镁含量高有利于饲养动物对血清离子的调节[50]。栅藻B38中的微量元素含量与林建云等[51]所研究的几种藻相差较小，试验所用栅藻B38中重金属元素含量均未超标。