转录因子EB在同型半胱氨酸诱导滋养细胞凋亡中的作用

柴丽芬 王艳华 吴琪瑞 王睿 李淑霞 刘林英 石青 吴凯 张慧萍

宁夏医科大学1临床医学院，2基础医学院（银川750001）；3宁夏医科大学总医院（银川750004）

子痫前期（preeclampsia，PE）是一种妊娠期特有疾病，胎盘滋养细胞的凋亡与增殖平衡失调是PE发生的关键[1]。研究[2]发现，与正常妊娠的妇女相比，PE患者胎盘滋养细胞凋亡数量明显增加，但其机制不清。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy），是蛋氨酸代谢过程中的重要产物，通过影响细胞功能、参与氧化应激、炎症反应以及改变基因表达活性等多种环节参与细胞凋亡调控，进而诱发疾病的发生[3]。另有研究[4]发现，正常妊娠时，血清Hcy浓度降低，而PE患者的血清Hcy浓度较正常孕妇升高，以上提示，在PE发生的过程中，Hcy可能促进胎盘滋养细胞的凋亡，但机制不清。转录因子EB（transcription factor EB，TFEB）是亮氨酸拉链转录因子家族中的成员，以磷酸化状态稳定于细胞浆，受到不良刺激后转位进入细胞核启动下游基因转录，从而参与多种病理生理过程，如：调节线粒体功能、增强细胞凋亡、抑制炎症因子释放等[5]，但其在Hcy引起的滋养细胞凋亡中的作用尚不清楚。因此，本研究以人源胎盘滋养细胞为研究对象，利用不同浓度Hcy干预滋养细胞并过表达TFEB后，检测凋亡相关指标的变化，从而探讨TFEB在Hcy诱导滋养细胞凋亡中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料人胎盘滋养细胞株（HTR8-S/Vneo）购自上海瑞鹿生物科技有限公司；RPMI1640培养基、胎牛血清（Gibco公司）；青链霉素、胰蛋白酶消化液（碧云天生物技术研究所）；CCK8试剂盒（日本同仁化学研究所）；Cell Viability Imaging Kit试剂盒（Roche Applied Science公司）RNA提取试剂盒、逆转录和qRT-PCR试剂盒（Takara生物公司）；蛋白提取试剂盒、蛋白定量试剂盒（南京凯基有限公司）；Cleaved-caspase3抗体（ab49822）、Bcl-2抗体（ab692）、TFEB抗体（D207D），羊抗兔或鼠二抗（Abcam公司）；引物由上海生工公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养采用含10%胎牛血清、1%双抗1640培养基，于37℃、含5%CO2的培养箱中培养滋养细胞（HTR8-S/Vneo）。

1.2.2 CCK8检测HTR8-S/Vneo细胞活力取对数生长期的HTR8-S/Vneo，制成2×103个/mL的细胞悬液接种于96孔板中，培养24 h待细胞贴壁及生长状态良好，换无血清培养基培养4 h后，各组分别加入不同浓度Hcy（0、0.1、0.2、0.5、1、2、2.5、5 mmol/L）孵育48 h，然后，每孔加入10 μL CCK8试剂，放至培养箱共同孵育4 h，取出培养板于酶标仪上490 nm测定各孔OD值，通过与正常组比较求出存活率。同时，绘制不同浓度Hcy对HTR8-S/Vneo生长活力的影响曲线图。

1.2.3 细胞活力荧光测定使用Cell Viability Imaging Kit试剂盒，检测前选择生长状态较好的HTR8-S/Vneo细胞，分为正常组和Hcy组：（1）Hcy组，细胞经 1 mmol/L Hcy处理 48 h；（2）正常组，10%1640培养基培养，然后使用细胞活力荧光测定试剂盒进行染色，共聚焦显微镜下观察两组细胞活力情况。

1.2.4 qRT-PCR法检测两组TFEB mRNA表达按照总RNA抽提试剂盒说明书抽提总RNA，分析样品纯度及浓度。根据GeneBank数据库查询TFEB的基因序列并设计相应引物。TFEB引物，上游：5′-ACCTGTCCGAGACCTATGGG-3′，下游：5′-CGTCCAGACGCATAATGTTGTC-3′，GAPDH 引物，上游：5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，下游：5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′，按反转录试剂盒说明书加入相应试剂反转录成cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR。荧光PCR反应条件为：95℃ 预变性 30 s，95℃变性5 s、57℃退火34 s，扩增40个循环。待反应结束后，分析qRT-PCR原始数据，用内参基因GAPDH校正，结果用2-△△CT计算。

1.2.5 TFEB腺病毒感染HTR-8/SVneo细胞委托上海吉玛制药技术有限公司构建TFEB腺病毒过表达载体，感染前选择生长状态较好的HTR8-S/Vneo进行培养，吸去旧培养液，PBS洗1遍，加入调整好滴度的腺病毒液，病毒感染细胞6 h后，弃掉培养液，加入新含血清培养液，感染48 h后，收集细胞。

1.2.6 Westernblot检测Cleaved-caspase3、Bcl-2、TFEB蛋白表达 收集各组滋养细胞，提取总蛋白并定量，加入上样缓冲液煮沸变性。每孔蛋白样品30 μg，SDS PAGE电泳，转移至孔径0.22 μm 硝酸纤维素薄膜；含5%脱脂奶粉的PBST室温封闭2 h；加入一抗（兔抗TFEB，1∶1 000；鼠抗Bcl-2，1∶1 000；兔抗Cleaved-caspase3，1∶1 000；β-actin兔抗，1∶1 000），4℃ 过夜；PBST 洗涤10 min，3次；再加入HRP 标记的二抗（1∶5 000），摇床孵育2 h；PBST洗涤10 min，3次；加入ECL显色底物，凝胶成像分析仪上成像。进行目的基因灰度值分析，以β-actin为内参对照。

1.3 统计学方法用Prism 5.0统计软件进行统计学分析，数据结果以表示，计量资料两组对比采用t检验，多样本均数间比较采用One-way ANOVA检验，组间的两两比较采用Student-Newman-Keuls检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hcy对滋养细胞存活率的影响不同浓度的Hcy干预HTR-8/SVneo细胞48 h后，CCK8法检测并计算各组细胞存活率。与正常组比较，Hcy干预后细胞存活率降低，在浓度为1 mmol/L时细胞存活率69.4%，而在2 mmol/L时，细胞存活率降低至33%（故后续实验中均选用1 mmol/L Hcy浓度为实验组），提示Hcy对滋养细胞生长有抑制作用。见图1。

2.2 细胞活力荧光测定观察Hcy对滋养细胞活力的影响1 mmol/L Hcy干预HTR-8/SVneo细胞后，细胞活力荧光测定法检测细胞活力（绿色为细胞有活力，红色为细胞无活力，蓝色为细胞核），结果发现：正常组细胞活力正常；Hcy组与正常组比较，红染细胞及细胞碎片明显增多，细胞活性显著降低。见图2。

图1 Hcy对HTR-8/SVneo增殖活力的影响Fig.1 Effect of Hcy on proliferation activity of HTR-8/SVneo

2.3 Hcy干预滋养细胞后Cleaved-caspase3、Bcl-2的蛋白表达1 mmol/L Hcy干预滋养细胞48 h后，运用Western blot检测Cleaved-caspase3、Bcl-2的蛋白表达改变。与正常组比较，Hcy组Cleaved-caspase3蛋白表达量增高，Bcl-2表达量降低，差异有统计学意义（P＜0.05），结果提示：Hcy可能促进滋养细胞凋亡。见图3。

2.4 Hcy干预滋养细胞后TFEB的表达1 mmol/L Hcy干预滋养细胞48 h后，采用qRT-PCR及Western blot检测TFEB的mRNA和蛋白表达水平。结果显示：与正常组比较，Hcy组中TFEB mRNA表达量降低，TFEB蛋白表达趋势与TFEB mRNA表达趋势一致，差异具有统计学意义（P＜0.05），提示Hcy抑制了TFEB的表达。见图4。

图2 Hcy干预HTR-8/SVneo细胞后细胞活力的变化Fig.2 Changes of cell viability after Hcy intervention of HTR-8/SVneo cells

2.5 过表达TFEB并验证表达效果为进一步探讨TFEB在Hcy促滋养细胞凋亡中的作用，将TFEB重组包装的腺病毒感染滋养细胞，并运用Western blot验证过表达效果，结果呈现出Ad-TFEB组TFEB表达显著升高，提示TFEB重组腺病毒感染成功。见图5。

2.6 过表达TFEB后检测滋养细胞凋亡的改变HTR-8/SVneo感染TFEB过表达腺病毒，同时再给予1mmol/L Hcy干预48 h后，运用Western blot检测各组细胞Cleaved-caspase3、Bcl-2蛋白表达。结果显示，过表达TFEB后，Cleaved-caspase3蛋白表达水平降低，Bcl-2升高，差异具有统计学意义（P＜0.01），提示TFEB抑制Hcy诱导的滋养细胞凋亡。见图6。

3 讨论

胎盘是母体与胎儿间进行物质交换的器官，其中胎盘滋养细胞是妊娠得以建立和维持的基础，占妊娠胎盘的主要部分。已有研究表明胎盘滋养细胞功能和形态异常影响其浸润、迁移及胎盘的种植[6-8]。PE患者胎盘滋养细胞凋亡较正常孕妇明显增加，提示妊娠期间胎盘滋养细胞凋亡可能是PE的重要致病因素之一[9]。同时，有研究发现，妊娠早期高的Hcy能影响滋养细胞的增殖从而影响其侵袭过程[10]。周登诗等研究发现，PE患者的血清Hcy浓度较正常孕妇升高，而在正常妊娠时，血清Hcy浓度是降低的[11-13]，这意味着在PE发生的过程中，较高浓度的同型半胱氨酸可能会导致滋养细胞的凋亡，从而影响其浸润、迁移及胎盘的种植。本研究中Hcy干预滋养细胞后发现，细胞活力及存活率均降低，凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3明显升高、Bcl-2降低，与文献报道一致。细胞凋亡通路包括死亡受体通路、内质网通路及线粒体通路，研究表明过高浓度Hcy可通过过度激活细胞内质网及线粒体应激，引起细胞凋亡[14-15]。其中，在线粒体应激途径中，Hcy诱导线粒体功能障碍，导致caspase依赖的级联凋亡反应激活，从而促进细胞凋亡事件发生。

图3 Hcy干预HTR-8/SVneo细胞后Cleaved-caspase3、Bcl-2的蛋白表达Fig.3 Protein expression of Cleaved caspase3 and Bcl-2 in HTR-8/SVneo cells after treated with Hcy

图4 Hcy干预HTR-8/SVneo细胞后TFEB的表达Fig.4 Expression of TFEB in HTR-8/SVneo cells after treated with Hcy

图5 TFEB腺病毒感染HTR-8/SVneo后Western blot检测TFEB的蛋白表达Fig.5 The protein expression of TFEB detected by Western blot after infected with TFEB adenovirus in HTR-8/SVneo

图6 过表达TFEB同时Hcy干预后检测Cleaved-caspase3、Bcl-2蛋白表达Fig.6 The protein expression of Cleaved caspase3 and Bcl-2 were detected after over-expressed TFEB and treated with Hcy

近年，研究发现TFEB这一家族的分子在脊椎动物中结构相似，具有遗传保守性，序列中都包含有一段可识别的DNA特殊结合的结构域，与细胞的发生和分化密切相关。并发现，TFEB可在多种类型的细胞中广泛表达，正常状态下大部分TFEB以无活性的磷酸化形式定位于胞浆，当受到负性应激时被激活脱磷酸化转位进入细胞核，通过识别、启动下游相应基因的转录，参与多种生理病理过程[5，16-17]。LI等[18]发现柠檬酸克罗米芬（CC），可促进TFEB的核易位，增加细胞的溶酶体生物发生，抑制细胞活力，导致细胞凋亡。在糖尿病足细胞，帕金森病患者神经细胞等的细胞凋亡过程中TFEB也均发生明显变化，提示TFEB可参与调控细胞凋亡，但目前在滋养细胞的凋亡中是否亦同样发生变化，尚无文献报道[16，19]。本实验利用Hcy干预胎盘滋养细胞促进滋养细胞凋亡模拟PE病理变化，检测TFEB的表达情况，发现较高浓度Hcy干预滋养细胞可导致其降低，提示TFEB在Hcy诱导的滋养细胞凋亡分子机制中可能起到了重要作用。为了进一步探讨TFEB在Hcy诱导的滋养细胞凋亡过程中的作用，本实验过表达TFEB后发现滋养细胞凋亡水平降低，暗示TFEB抑制了Hcy诱导的滋养细胞凋亡。同时，在KANG等[20]的研究中发现，过表达TFEB可以明显增加抗氧化应激蛋白的表达，促进线粒体生物合成，维持线粒体稳态，从而抑制凋亡的线粒体调控途径。

综上，TFEB在Hcy诱导滋养细胞凋亡的分子机制中可能起到保护作用，这就提示TFEB可能参与了高Hcy致PE的发病过程，但机制不明，是否与其抑制凋亡作用相关需进一步研究。