生姜多糖提取分离及含量测定研究进展*

2020-01-16张文森王知斌匡海学

化学工程师 2020年8期

张文森，崔娜，野津，王知斌，匡海学

（黑龙江中医药大学，教育部北药基础与应用研究重点实验室，黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江哈尔滨 150040）

生姜（Ginger Officinale Rose）属于姜科植物，在中国具有2000多年的栽培历史。其作为药食两用的中药，在日常生活中作为常用的调味品，在中药使用的过程中也是常见的解表药，因其具有出色的止呕作用，因此，拥有“呕家圣药”的美誉[1,2]。生姜的主要有效成分生姜油、精油树脂、姜辣素、淀粉、膳食纤维以及色素和矿物质等营养成分，多糖含量达到了大约6%。多糖近些年来发现其具有降血糖，提高免疫力，降血脂，抗肿瘤等多种生物活性[3]。是生命活动中必不可少的主要成分，它与维持生命活动的许多机能具有密切相关的联系。所以深入姜科多糖具有广阔的前景，为临床和食品等行业的深入研究提供理论依据。

1 姜科多糖的提取分离

1.1 预处理

因多糖的存在形式和提取的方法不同，在提取分离之前采用相应的预处理方式进而去除杂质。其具有易溶于水，难溶于醇的性质，采用一定浓度的乙醇去除多糖中单糖，生物碱，氨基酸等脂溶性杂质。王芸[4]将鲜姜洗净去皮之后，在55℃的烘箱内干燥12h，索氏提取2次后去除溶剂，得到去除单糖，生物碱，氨基酸等脂溶性杂质的脱脂的生姜粉。

1.2 溶剂提取法

多糖是极性大分子化合物，易溶于水，难溶于乙醇，所以常用水作为溶剂提取多糖。可以用热水提取多糖，也可以冷水提取，通常情况用热水提取植物多糖，然后用高浓度的乙醇沉淀浓缩过后的水煎液得到粗多糖。王振斌[5]通过控制提取时间，提取温度和液料比3个条件进行正交实验筛选出最佳条件为液料比为 20∶1，提取温度为 90℃、提取时间为 2.5h；在此工艺条件下，生姜多糖的提取率为5.82%。冯鑫[6]通过水提醇沉法对生姜皮多糖进行提取，以粗多糖的得率为指标进行评价指标，最终得到最佳的反应条件为液料比 30∶1（mL·g-1）、提取时间为 2h、提取温度70℃进行热水浸提。再加入4倍体积无水乙醇的同时不断搅拌使浓度达到80%以上，在4℃条件下沉淀12h，离心取沉淀。综上所述研究发现溶剂提取法具有廉价，无毒，方便等优点广泛应用于多糖提取工艺中。

1.3 超声波提取法

超声波提取法是一种新型提取技术，相对于热水提取法，可以充分提取胞内有效成分的溶出。其具有耗能低，操作时间短，提取率高等诸多优点。赵文竹[7]采用超声波提取辅助法提取生姜多糖，通过单因素实验的方法分别考虑超声时间，超声处理温度，液固比和超声功率等4个条件计算生姜多糖的得率。探得最佳实验条件为超声温度为45℃，液固比为50∶1，超声功率为350W，超声时间为20min。结果显示多糖得率为6.79%，预测值为6.87%，实际值与预测值偏差不大，具有很好的参考价值。刘全德[8]采用响应曲面法优化超声波-微波协同萃取生姜多糖，考虑了生姜提取过程中粒度的影响，测得最佳的反应条件为液料比为20∶1，微波功率为250W，处理时间为60min，粒度为40目。

1.4 复合酶法

复合酶法用于生姜多糖的提取，可以加速生姜细胞的破裂，有利于细胞中多糖的溶出，从而达到提取时间短，提取率高，减少耗能，有利于保存生姜多糖生物活性的优点。马利华[9]采用复合纤维素酶，果胶酶，蛋白酶用于生姜多糖的提取。通过考证酶的用量，酶作用的pH值，酶作用温度，酶作用温度和复合酶配比的正交实验进而考察出最佳的实验条件。最后通过实验数据得知最佳条件为：实验温度50℃，pH值为 4.5，反应时间为60min，复合酶最佳配比为纤维素酶用量为1.0%、果胶酶用量为0.5%、木瓜蛋白酶用量为2.0%。

2 生姜多糖的分离纯化

因实验多采用水提醇沉法提取多糖，粗多糖中含有大量小分子化合物，为后续生姜多糖的使用和成分分析带来负面影响。因此，需要将粗多糖分离纯化，以提高纯净度。

2.1 除蛋白

目前，研究中多糖去除蛋白的方法主要有：盐酸法、酒精变性法、蛋白酶法和联用法等方法[10]。秦卫东[11]通过Sevag法、三氯乙酸法、鞣酸法3种常见的去蛋白法进行去除生姜多糖中的蛋白，交叉试验结果表明，三氯乙酸法的综合评价效果优于其他两种方法。三氯乙酸法[10]通过蛋白质在有机酸中形成不可逆的沉淀原理，从而去除生姜多糖中的蛋白。具体的实验方法为在多糖溶液中加入体积1∶1（v/v）浓度为3%～10%的三氯乙酸溶液。充分混匀后隔夜静置，离心去除蛋白沉淀，重复以上操作直至无沉淀产生为止。如果与正丁醇（v/v=1∶10）混合使用进而达到更好的脱蛋白效果[12]。

2.2 脱色素

目前，常用的色素去除方法有：离子交换法、吸附法、大孔树脂法和氧化法等[13]。离子交换法是利用弱碱性树脂DEAE-纤维素，其具有吸附作用，吸附色素达到脱色的效果，并且具有很好的多糖分离效果。活性炭吸附法因其比表面积比较大，具有很强的吸附脱色能力。大孔树脂法[14]脱色是一种新型的分子材料，具有吸附量大，易脱色，脱色范围广等优点，在医药，工厂加工等领域应用广泛。王芸[4]将生姜粗多糖溶液进行大孔树脂纯化脱色。根据其实验结果表明，大孔树脂脱色效果显著，多糖含量相对减少较少。

2.3 柱色谱分离

多糖的分离方式主要有凝胶柱层析法、离子交换层析法和大孔树脂柱层析等[15]。离子交换层析法以离子交换剂为固定相，以特定的离子溶液为流动相进行梯度冲洗，利用固定相离子交换剂上的可交换离子与周围存在的离子亲和力不同进而实现有效分离。因此，特性决定了离子交换层析法具有离子交换的作用和分子筛的作用。目前DEAE-cellulose作为最常用的交换剂。凝胶柱层析法根据多糖分子的大小不同，利用分子筛技术进行分离。

Liao[16]采用DEAE 纤维素52柱（2.6cm×30cm），蒸馏水，NaCl溶液（0，0.1，0.3，0.5，0.7mol·L-1NaCl）为流动相，用3种方法对生姜粗多糖进行纯化。以蒸馏水为洗脱液，用 Sephadex G-200（2.6cm×30cm）进一步纯化不同流动相洗脱的组分。纯化后的生姜粗多糖经收集、透析、冻干等进一步研究。

3 含量测定

目前，多糖含量的测定主要有两类方法：（1）直接测定多糖含量的方法，如HPLC-MS，GC-MS和酶法等；（2）利用组成多糖的单糖缩合反应为基础建立的间接测量多糖含量的方法，如苯酚-硫酸法，蒽酮-硫酸法等[17]。孔得福[18]采用苯酚-硫酸法在490nm吸光光度值处测得多糖含量为4.62%。侯英梅[19]测得生姜粉与水的最佳比例为1∶16，在90℃的条件下提取2.5h较为理想的条件，利用苯酚-硫酸法测得生姜粉的多糖含量为7.63%。王芸[4]采用蒽酮比色法在620nm的分光度下测定不同条件下制得生姜多糖的含量。由此可见苯酚-硫酸法和蒽酮比色法是常见的两种测得多糖含量的方法，由于操作简单，重复性好，显色稳定等优点，适用于生姜多糖的含量测定。