干腌火腿中微生物多样性及其分析方法的研究进展

陈林，王正莉，吉莉莉，王卫，张佳敏

(成都大学肉类加工四川省重点实验室，成都 610106)

干腌火腿 (dry-cured ham)是用带骨、皮、爪尖的整只猪腿经腌制、洗晒、风干和长期发酵、整形等工艺制成的一种生肉制品[1]。干腌火腿作为传统发酵食品之一，有着悠久的发展历史。几百年来，不同地域间人们生产加工火腿的工艺各有不同，逐渐形成了不同地域特点的产品。国外著名的干腌火腿主要有法国的Bayonne火腿和Corsican火腿、西班牙的 Iberian火腿和Serrano火腿、意大利的Parma火腿和Light Italian Country火腿、美国的Country-style火腿和德国的Westphalia火腿，而我国较著名的有浙江金华火腿、江苏如皋火腿、云南宣威火腿、贵州盘县火腿等[2-5]。

1 干腌火腿中微生物的作用

干腌火腿中对发酵起到重要作用的菌群主要有葡萄球菌、乳酸菌、酵母、霉菌等。干腌火腿中的米酒乳杆菌具有蛋白酶和脂肪酶的活性，一些细菌素对产品风味及贮藏性的提高具有重要作用。葡萄球菌和微球菌能起到分解过氧化物、降解蛋白质和脂肪的作用。有研究报道发现，宣威火腿中的一些葡萄球菌、微球菌与霉菌共同作用，对火腿独特风味的形成具有基础性作用。霉菌对火腿外观的形成有重要作用，通过霉菌生长一方面可以消耗氧气，防止肉品氧化、褪色，另一方面可以抑制腐败菌的生长。霉菌还可以生成蛋白酶、脂肪酶，使产品产生独特风味物质。火腿上的霉菌与火腿色、香、味的形成有着直接关系，在金华火腿传统生产工艺中，霉菌的各项特征是感官检查火腿质量好坏的标志之一。酵母的作用在于能使火腿中的维生素E、脯氨酸等香甜成分增加[6]。

2 干腌火腿中微生物菌群的分析方法

目前用于干腌火腿中微生物的相关研究方法主要包括两大类，一类是纯培养分析法[7,8]，另一类是借助分子生物学手段的免培养分析法[9]。

2.1 纯培养分析法

纯培养分析法是利用不同的培养基对试样中的微生物进行培养，然后通过形态学、生理生化等方法进行分离、计数、鉴定，得到微生物多样性数据的一种传统有效方法。目前，对干腌火腿微生物多样性相关的研究报道大多采用此种方法。

胡萸英等[10]早在20世纪80年代就用纯培养法从金华火腿中分离出大量微生物。其中霉菌主要有青霉(Penicillium)、曲霉(Aspergillus)、芽枝霉(Cladosporium)、交链孢霉(Alternaria)等。酵母菌主要有裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、隐球酵母属(Cryptococcus)等。细菌主要为芽孢杆菌属(Bacillus)、微球菌属(Micrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、假单胞杆菌属(Pseudomonas)、黄杆菌属(Flavobacteriu)等。甄宗圆等[11,12]发现用传统工艺加工金华火腿过程中，上盐后，火腿内部微生物数量减少，进入发酵房后很快可增加至最高106CFU/g，但在火腿成熟生香期，内部微生物数量又下降至103CFU/g。内部细菌占优势的是葡萄球菌，其次是乳酸菌(主要有消化乳杆菌、马脲片球菌和戊糖片球菌等)，变异微球菌的数量也较多。内部酵母菌群中主要有类筒假丝酵母、汉逊德巴利酵母、赛道威汉逊酵母、红酵母等。余翔[13]发现现代工艺加工过程中金华火腿内部的细菌优势种为乳酸菌、葡萄球菌；内部主要的酵母菌是欧诺比假丝酵母、红酵母、赛道威汉逊酵母、白色布勒掷孢酵母、多形汉森酵母等。

江东福等[14]研究宣威火腿时鉴定出表层生态菌圈中有17个属的真菌群：曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、木霉属(Trichoderma)、根霉属(Rhizupus)、毛霉属(Mucor)、拟青霉属(Paecilomyces)、长蠕孢霉属(Helmithosporium)、交链孢霉属(Alternaria)、镰刀菌属(Fusarium)、刀孢霉属(Clasterosporium)、葡柄霉属(Stemphylium)、束丝菌属(Ozonium)、胶霉属(Gliocladium)及酵母和酵母状真菌中的酵母属(Saccharomyces)、汉逊氏酵母属(Hansenula)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、黑酵母(black yeast)和7个属的放线菌群。曲霉、青霉、酵母和链霉菌等属是宣威火腿的主要菌群。马萍等研究认为宣威火腿酵母菌群占火腿总菌群的60%～70%，青霉、木霉、根霉、毛霉、黑曲霉等有益或无害菌群占8%～15%，烟曲、黄曲、杂曲霉等无益菌群占7%～10%，细菌占10%左右。李平兰等[15]研究发现宣威火腿中的优势菌为葡萄球菌、微球菌和霉菌，而乳酸菌及肠杆菌、肠球菌的数量均明显低于优势菌群。

蒋云升等[16]对如皋火腿微生态体系进行的研究表明, 火腿中心部位发酵前期的菌系构成为嗜盐性球菌、杆菌和酵母, 中期以球菌和酵母为主, 后期只有球菌和少量的酵母分布。

李欣蔚等[17]用传统培养法研究发现剑门火腿中的微生物主要为葡萄球菌、微球菌和酵母菌，其表层数量明显高于内部，乳酸菌主要分布于火腿内部，霉菌主要存在于火腿表层。

胡永金等[18]对传统工艺制作的三川火腿加工中微生物区系的动态变化规律进行了研究，发现腌制期、风干期和焐灰期分别为三川火腿表面以及内部细菌和葡萄球菌数量的增长期、稳定期和减少期; 除腌制初期外，火腿内部假单胞菌数量均高于其表面，且在整个加工过程中由于微生物之间的竞争性关系呈逐渐降低趋势，腌制后期为火腿表面和内部霉菌数量的急剧增长期，但在焐灰期骤减。

党喜军[19]用传统纯培养法研究发现诺邓火腿表面微生物非常丰富，3年期火腿的细菌和真菌类群丰度最高。霉菌中的优势菌群为曲霉属(Aspergillus)，酵母菌类群的优势菌群为德巴利氏酵母属(Debaryomyces)和假丝酵母属(Candida)，细菌类群中的优势菌群为葡萄球菌属(Staphylococcus)。此外，芽孢杆菌属细菌也被分离检测到，该属菌群大多能产生具有较强蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性的消化酶，有利于火腿中大分子物质的分解。

纯培养分析法最大的优点是可以获得培养菌株，对后续功能菌株的筛选与应用提供丰富的资源。许多研究者基于培养依赖法对分离出的微生物进行了大量的研究。Lori等[20]从Parma火腿内部样品中分离出了耐盐菌。潘明等从筛选到能够产鲜、产香的5株葡萄球菌、2株杆菌、1株酵母菌，发现筛选的菌株都有较好的耐盐性、耐亚硝酸盐性，其中一些菌株具有蛋白酶和脂肪酶活性。并将其中部分菌株组合为发酵剂，进行了火腿发酵工艺的优化，得到了较好的发酵效果。顾于滨[21]按照肉制品发酵剂筛选标准从金华火腿发酵菌中筛选出了植物乳杆菌、弯曲乳杆菌和木糖葡萄球菌。将其运用于发酵香肠的生产，发现植物乳杆菌和木糖葡萄球菌能通过抑制脂肪的氧化显著改善发酵香肠的品质，并且能通过减少生物胺的形成来提高香肠的安全性。

2.2 免培养分析法

采用传统常规分离纯化和培养的方法来研究火腿中的微生物存在着不可避免的缺陷[22]，据报道，在自然界中有90%～99%的微生物用传统方法无法培养出来，这就人为改变了原始菌群的微生态构成，对研究结果造成较大偏差[23]。因此，以免培养分析法为基础的分子生物学方法开始在火腿微生物多样性研究中被运用。目前在干腌火腿中已被开发应用的主要是高通量测序技术(high throughput sequencing，HTS)。该技术不需要大规模的投入，对加速生物学及生物医学的研究具有引人瞩目的作用[24]。它通过测定样本中存在的细菌16S rRNA、真菌16S rRNA或内转录间隔区(ITS)特定区域碱基序列，可一次性对几十万到几百万条的DNA分子进行序列测定[25]。高通量测序技术可以检测到大量不同分类水平的微生物，包括纯培养物和许多未知的新分类单元。Ge Qingfeng等[26]用高通量技术比较了具有5年、15年和30年金华火腿厂不同厂龄厂家生产的火腿产品微生物多样性情况，共获得了18个门、242个属的微生物，不同厂龄产品中微生物多样性结构特点和风味物质情况有显著性差异，结果提示不同厂龄金华火腿厂可以形成特有的平衡的微生物多样性结构，可能对火腿独特风味的形成有贡献。党喜军用高通量测序技术对诺邓火腿的真菌研究表明，优势真菌类群主要分布在子囊菌门和担子菌门，种类最多的4个属分别为尾孢属、假丝酵母属、节担菌属、曲霉属。细菌高通量测序结果发现，厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、蓝菌门和放线菌门是门水平优势细菌类群，而属水平优势细菌类群主要是葡萄球菌属、嗜冷杆菌属和志贺氏菌属。

母雨等用Illumina高通量测序技术从盘县火腿中共鉴定出24个细菌门，433个细菌属，其中厚壁菌门、变形菌门和放线菌门是最多的；共分离鉴定出2个真菌门，68个属，优势菌是子囊菌门。

张诗意等[27]通过PCR法鉴定出了贵州威宁火腿中的10株菌株，其中有4株马胃葡萄球菌(Staphylococcusequorum)、2株木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)、2株乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、1株变平滑假丝酵母菌(Candidametapsilosis)和1株近平滑假丝酵母菌(Candidaparapsilosis)；并发现了部分菌株有较强的耐盐和耐低温能力。

邹颖玲等[28]利用PCR-DGGE技术从不同加工年份宣威火腿中检测到27种真菌，主要有：Aspergilluspseudoglaucus，Phialosimplexcaninus，Aspergilluspenicillioides，Yamadazymatriangularis，Wallemiasebi，Candidaglucosophila等，其中Aspergilluspseudoglaucus是优势菌种。多样性分析表明，加工3年的宣威火腿表面真菌群落多样性最高，加工2年的火腿表面真菌群落多样性最低。加工2年的火腿内部真菌群落多样性最高，加工3年的火腿内部真菌群落多样性最低。

免培养分析法中，除了高通量测序技术外，变性梯度凝胶电泳(DGGE)、实时荧光定量PCR等也被广泛应用到了微生物多样性的研究中[29]。另外，DNA宏条形码、寡核苷酸配型技术、Biolog微平板法，脂肪酸甲酯谱图法、荧光原位杂交(FISH)、RFLP等相关技术也是微生物多样性分析的常用技术[30]。

3 总结与展望

目前，火腿微生物多样性相关研究结果主要还是用传统培养法获得，PCR-DGGE和高通量测序等相关技术还很少有报道。DNA宏条形码、寡核苷酸配型技术、Biolog微平板法、脂肪酸甲酯谱图法、荧光原位杂交(FISH)、RFLP等分析方法在获取微生物多样性信息方面各有优劣，因此为了获取更加全面、准确的微生物群落组成、结构及变化等信息，需要结合实际研究目标，采取多层次、多角度的研究手段，通过多种分析方法的互补，实现准确、完整解析微生物群落及其代谢产物的动态变化过程，从而实现火腿发酵过程中产品品质、安全及稳定的可控性。