牛传染性鼻气管炎诊断方法研究进展

杨飞，宋志峰，刘丹，黄小洁，侯力丹，郎洪武*

(1.中国兽医药品监察所，北京 100081；2.东北农业大学，哈尔滨 150000)

牛传染性鼻气管炎(infectious bovine rhinotracheitis，IBR)在临床上主要以呼吸困难、气管黏膜发炎等呼吸道症状为特征，又因会同时引起脓疱性外阴阴道炎，故又称为传染性脓疱性外阴阴道炎，还可引起公牛龟头炎、母牛流产、结膜炎、幼牛脑膜脑炎等，被认为是可由同一种病原引起的多种病症的疫病[1]。牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)又名牛疱疹病毒1型(bovine herpesvirus 1，BHV-1)，属于疱疹病毒科水痘病毒属，有4个亚型和一个血清型。IBRV感染牛后可在三叉神经形成潜伏感染和持续性感染，病牛终生带毒。在应激条件下，该病毒可被激活使机体排毒而引起该病在牛群中的传播流行，这也为消灭和根除该病埋下了隐患，增加了困难。

20世纪50年代，以传染性鼻气管炎症状为特征的疾病最先见于美国科罗拉多州的育肥牛群，后因贸易交易使得IBRV广泛流行于欧洲[2]。该病在全世界流行，目前只有少数欧洲国家采取消灭扑杀、禁止疫苗接种等方式根除了该病，如瑞士、奥地利、芬兰等，其他国家均有该病的报道[3]。2002年至2009年的血清调查报告结果表明，欧洲牛群中IBR血清阳性率为50%～90%，比2000年的调查结果有明显提高。2013年，巴西发现一例IBR病例。2015年，澳大利亚出口的活牛IBR血清阳性率已高达39%。在我国，IBR属于外来病，首次被发现是在1980年，周泰冲等从新西兰进口奶牛中分离得到，此后该病在我国的流行趋势也是不断上升。2007年，gE-ELISA方法检测奶牛血清的数据结果显示，我国IBR血清学个体阳性率为35.8%[4]。2016年有文献报道我国上海崇明岛地区两个规模化奶牛场的IBRV抗体阳性率分别为41.2%和74.3%，新疆五个规模化牧场 IBR 血清学检测阳性率为 80.7%，宁夏地区IBRV抗体检测平均阳性率高达85.1%[5-7]。这些数据表明了IBR在我国牛群中感染的普遍性和严重性。但我国是养牛大国，根除IBR耗资巨大，对于发展中国家很不适用，所以为有效控制IBRV的扩散传播，建立有效的诊断方法以及时监测和预防IBR才是关键。本文综述了IBRV的最新国内外检测方法研究进展，以期为检测和防控IBR提供参考。

1 病原学诊断

1.1 病毒的分离鉴定 IBRV可在多种原代或传代细胞中生长，如牛胎肾、肾上腺、甲状腺、睾丸、鼻甲骨等细胞中生长，目前普遍使用的是牛肾传代细胞(MDBK)和牛气管传代细胞(BTC)。一般根据病牛的临床症状，选择不同的部位进行病料的采集，呼吸道型病牛主要采集鼻液或眼分泌物；眼结膜型病牛主要采集眼分泌物；脑膜脑炎型病牛主要采集脑组织；生殖道型母牛主要采集外阴阴道分泌物和外阴部黏膜，公牛主要采集精液和包皮；流产型病牛可采集肺脏、肝脏、肾脏等实质性器官或胸腔积液。IBRV首次分离不易出现典型的病变(CPE)，需要盲传2～3代后再进行观察。将采集的病料处理后接种到适宜的细胞上，细胞病变一般在3～5 d。典型的CPE为细胞圆缩、聚集成葡萄样的细胞团，细胞团之间形成空洞以及多核巨大细胞的产生。若要进一步鉴定是否为IBRV感染，可用IBRV单克隆抗体或者抗血清进行中和试验，或间接免疫荧光试验。孔繁德等[8]将采集的鼻拭子和血清混合震荡后离心，其上清液接种于单层的MDBK细胞，盲传3代后出现典型CPE，IBR阳性血清作用于该单层细胞后，CPE被明显抑制。冷雪等[9]采集内蒙古发病牛的鼻拭子液并经过MDBK细胞传代培养以及PCR、间接免疫荧光试验和动物回归试验分离鉴定出一株IBRV。病毒分离鉴定方法虽然可靠，但整个过程比较复杂，费时费力，效率不高，所以在临床上不推荐使用。

1.2 病毒核酸检测

1.2.1 聚合酶链式反应(PCR) 1985年，Mullis等[10]向全世界推广PCR方法以后，由于该技术快速、特异、敏感、费时少的优点，已广泛应用于分子生物学领域，可用于检测血清、组织、鼻拭子、精液中的病毒。研究者针对IBRV基因组编码蛋白的不同，设计特异性引物，建立PCR方法，用于检测IBRV。林梅等[11]根据IBRV TK基因设计引物，建立了可鉴别TK基因缺失株与野毒株的PCR方法。徐娜等[12]根据GenBank中IBRV gE和gB基因序列，设计了2对特异性引物，建立了特异性强、准确、快速的PCR方法。同时还可根据病原种类的不同，建立同时检测多种病原的多重PCR方法，可达到更高效、简便的目的。范晴等[13]建立了同时检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛支原体和IBRV的三重二温式PCR方法，为这3种病原的诊断提供了一种方便使用的方法。杨帆等[14]建立了同时检测牛副流感病毒3型、IBRV、BVDV和牛支原体多重PCR检测方法，可鉴别诊断4种病原，具有特异性强，灵敏度高的特点。PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，能将微量的DNA以指数方式增加，且对模板提取物纯度要求低，能达到灵敏度高、简便、快速的要求，但是该方法易出现假阳性、假阴性的结果，也有一定的缺陷。

1.2.2 荧光定量PCR(qPCR) 荧光定量PCR 是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，标记跟踪PCR产物进行实时监测反应，利用与之相适应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。该方法已广泛应用于分子生物学、医学、食品检测和环境监测等多个领域，且与普通PCR相比，具有更高的特异性和敏感性。目前实验室常用的荧光化学方法有两种，分别是DNA结合染料(SYBR Green I)和标记上荧光染料的特异性寡核苷酸探针(TaqMan探针、杂交探针)。季新成等[15]根据BHV-1 gB基因序列，设计高度保守的引物和荧光探针，建立了含有内标物的荧光定量PCR检测体系，灵敏度比常规PCR和病毒分离高出10～100倍，与不加内标的荧光PCR检测灵敏度相当，且内标模板可监测、指示并校正假阴性结果,从而提高PCR检测准确率。该方法的建立可实现临床样品中BHV-1的快速检测，加强实验室的质量控制。谢志勤等[16]根据IBRV gB基因序列和BVDV 5′端非编码区序列的保守区域,分别设计1对IBRV的特异性引物和1条FAM标记的TaqMan探针，1对BVDV的特异性引物和1条ROX标记的TaqMan探针,建立了双重荧光定量PCR方法，适用于临床样品的鉴别检测。宋爽等[17]根据高度保守的BVDV的5’UTR基因、IBRV的gB基因和口蹄疫病毒(FMDV)的3D基因,分别设计了3对对应的特异性引物和3种不同发光基团标记的TaqMan探针，建立了同时检测这3种病毒的多重荧光定量PCR方法，可同时快速鉴别检测BVDV、IBRV和FMDV。张颖慧等[18]首次建立了检测IBRV核酸的恒温隔绝式PCR(iiPCR)方法，该方法配合PetNAD核酸萃取试剂盒，从核酸提取到报告检测结果仅需1 h，具有操作简便、快速、可现地化的特点。Shubhada K Chothe等[19]开发了一种新型的基于核苷酸多态性(SNP)的PCR检测方法，通过illumina Miseq平台对来自宾夕法尼亚州和明尼苏达州的18株BHV-1分离株和5株BHV-1疫苗株进行全基因组测序，基于SNP可将序列分为两个不同的疫苗株组和一个野毒株组。该方法可以区分疫苗株和野生型毒株，帮助准确确定BHV-1的发病率以及疫苗接种与牛临床发病的关系。

1.2.3 等温扩增技术 环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)，能在等温(60～65 ℃)条件下，短时间(通常是1 h内)内进行核酸扩增，是一种简便、快速、精确、低价的基因扩增方法。与常规PCR方法相比，该方法不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，是一种全新的核酸扩增方法，可不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR，也为IBRV的快速检测提供了新的技术。郭利等[20-21]从NCBI数据库中获得的IBRV的保守gE序列，分别建立了LAMP可视化检测方法和应用金纳米颗粒与PCR结合的纳米PCR(nano-PCR)新型检测方法。LAMP方法可检测到2.23×103copies/μL的BHV-1基因含量，其临床样品的阳性检出率高于普通PCR。Nano-PCR方法的敏感性是LAMP和普通PCR方法的10倍，其敏感性和特异性更适合于临床样品的检测，且可与 LAMP 配合使用，为IBR 的筛查和治疗预防提供了技术支撑。高峰等[22]根据 GenBank 中发表的 IBRV 全基因序列，利用 MEGA 3.1 进行同源性比对，选择基因中的高度保守区域设计了LAMP引物，建立了可视化IBRV LAMP检测方法，适用于口岸进出口动物的 IBR 快速检疫。董世娟等[23]根据IBRV gB基因保守序列设计了3对LAMP引物建立了IBRV可视化LAMP方法，该方法可以检测到10 copies/μL的质粒 DNA，与 nested-PCR 方法的敏感性相当，比 PCR 方法敏感1000倍，适合基层和现场对临床样本进行快速检测。聚合酶螺旋反应(PSR)是等温技术领域的新成员，Malla J A等[24]已成功建立了PSR方法，用于检测流产的牛胎儿组织和牛精液中的BHV-1。该方法比传统PCR灵敏100倍，与实时PCR相当，可在冷冻精液站和奶牛群中快速、准确、灵敏地检测BHV-1。

1.2.4 基因芯片技术 随着人类基因组计划的逐步实施以及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因组序列得以测定，一种新型、高效、快速检测和分析遗传信息的杂交和测序方法得以建立，即基因芯片技术。季新成[25]将标有荧光染料的 PCR产物变性后与芯片上寡核苷酸探针杂交，对IBRV重组DNA 的检测灵敏度均为 103copies/μL；同时还建立了IBRV、BVDV和犬新孢子虫3种病原的悬浮液态芯片检测技术，对IBRV的检测灵敏度为103copies/μL，具有较好的特异性和可重复性。陈圣军等[26]根据 IBRV gB 基因和赤羽病病毒 S 基因序列设计合成了 2 对特异引物和探针，建立了同时快速检测这两种病毒的基因芯片检测方法。魏春霞等[27]建立了牛布鲁氏菌病、结核、炭疽、FMD、BVD、副流感、IBR可视化基因芯片检测方法，根据已公布的各病原核酸序列，设计了引物和探针，并将PCR产物与探针特异性杂交，从而实现了一次试验即可对7种病原的同时快速检测。该基因芯片检测方法单一病原灵敏度检测可达1.0×10-6ng/μL,混合病原灵敏度检测可达1.4×10-5ng/μL，具有高通量、高灵敏度、高特异性等特点。

2 血清学诊断

2.1 酶联免疫吸附试验(ELISA) ELISA方法已被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。在动物检疫方面，ELISA在猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病等的诊断中已为广泛采用的标准方法，也是OIE指定的检测IBRV的方法之一。该方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 (聚苯乙烯微量反应板) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，具有灵敏、快速、特异、操作简单等优点。常用的 ELISA 法有双抗体夹心法和间接法，目前在市场上占据主导地位的是间接ELISA试剂盒。IBRV的gB、gC、gD、gE和gG为其主要的免疫原性蛋白，这些蛋白已先后被学者研究作为IBRV检测的靶蛋白用于建立ELISA方法。曹翀等[28]建立了IBRV gB蛋白为检测抗原的间接ELISA方法。Bertolotti等[29]建立了检测IBRV gE抗体的间接ELISA方法。马辉[30]、周跃辉[31]等分别制备了gC和gD的单克隆抗体，建立了双抗体夹心ELISA方法。向文杰[32]制备了IBRV VP8蛋白单克隆抗体并以全病毒为抗原制备了阻断ELISA方法。张帆[33]对我国IBR的流行情况做了Meta分析并建立了gE间接ELISA方法，可用于奶牛场中IBR的流行病学调查。Barbara Colitti等[34]利用IBRV gE间接ELISA方法检测混合牛奶样品中的IgG浓度，该方法显现出了非常好的诊断性能，且降低了检测成本，可用于控制游离和接种标记的奶牛群中的IBR。

2.2 中和试验(VN) 中和试验是最标准、最经典的血清抗体检测方法，也是OIE指定的试验检测方法之一。由于IBRV只有一个血清型，只要用标准毒株的免疫血清在细胞培养后进行中和试验就可鉴定，但受病毒效价、血清与病毒的孵育时间长短等因素的影响，使得该方法具有耗时费力结果易受外界因素影响等缺点。因为IBRV可以潜伏感染，所以，即使牛群血清抗体检测为阴性，仍不能保证牛无病毒感染[35]。

2.3 间接血凝试验(IHA) 间接血凝试验是一种简单易行的血清抗体检测方法，可用常规的试管凝集法和微量凝集法进行。但IHA易受诸多因素影响，出现假阳性的结果。陈天祥[36]、杨春明[37]等分别建立了IBRV的IHA方法，结果较好。

2.4 间接免疫荧光试验(IFA) IFA主要用于检测抗原，是一种操作简便、快速、特异性高的检测方法。该方法中可用BALB/c小鼠制备的IBRV单克隆抗体为一抗，加到接种IBRV的细胞培养物中，以FITC(异硫氰荧光素)标记的抗鼠免疫球蛋白为二抗，置荧光显微镜下观察荧光结果即可。IBRV单克隆抗体的高特异性使得IFA方法可不局限于只用IBR阳性血清作为一抗才能检测出抗原，更加丰富了该方法的内容。

2.5 琼脂扩散试验(AGP) AGP既可用于检测抗原，也可检测抗体，操作简便，但敏感性较低，只有感染牛抗体呈现出很高的滴度时才能被检出，应用价值不高。

2.6 胶体金检测技术 胶体金检测方法也是一种快速简单的检测抗原或抗体的方法。王武军等[38]建立了斑点免疫金渗滤法(DIGFA)检测IBRV抗体，仅需5 min即可判定结果。梅力等[39]用胶体金将sf9昆虫细胞-杆状病毒系统重组表达的IBRV-gD蛋白标记作为示踪抗原，未标记的gD蛋白作为捕获抗原，以羊抗牛IgG抗体作为质控抗体，建立了IBRV双抗原夹心法胶体金检测试纸条，该试纸条与IDEXX的IBRV抗体ELISA检测试剂盒的阳性符合率为93.5%，阴性符合率为96%，可用于临床IBRV抗体的检测和诊断。

3 结 语

IBR在我国区域内分布不均，且在奶牛中阳性率呈上升趋势，说明近年来我国IBRV在奶牛群中感染越来越严重。我国是养牛大国，养牛业正向集约化、规模化发展迅速，且进出口奶牛数量巨大，贸易频繁，这更加速了IBR的流行与传播，给我国养牛业带来了巨大损失。欧洲几个国家采取了根除IBR的计划，也取得了显著成效，但综合考虑各种因素，根除计划并不适用于我国。国内商品化的IBR疫苗近两年才获得新兽药证书并上市，为牛病毒性腹泻/黏膜病、牛传染性鼻气管炎二联灭活疫苗，这为国内IBR疫苗的研发打下了基础，同时也说明加强病原检测技术和方法研究对预防和控制该病的重要性。

综上所述，检测IBRV的方法各种各样，但是每种方法都有其优缺点和实用性，qPCR方法、LAMP方法和基因芯片技术相较于PCR方法，敏感性高、特异性强、高效、不易出现假阴性结果，且LAMP方法和基因芯片技术是近期出现的较为先进和有代表性的新型检测方法，操作简便，临床上可达到高通量、快速检测的目的。血清学检测中ELISA方法为OIE指定的检测IBRV的方法之一，且在国外也有商品化的试剂盒应用，而间接免疫荧光方法虽然需要病毒接种细胞后才能进行，但该方法相较于ELISA方法特异性强，敏感性高，不会出现假阳性，这两种方法均成本低，可实现大批量检测。但在实际情况下还应因地制宜，具体情况具体分析。胶体金检测技术和LAMP方法特别适合于广大基层检验人员以及大批量检测和大面积普查等, 其结果快速且肉眼可见，具有巨大的发展潜力和广阔的应用前景。而qPCR、ELISA、间接免疫荧光和中和试验等需要在实验室条件下进行，中和试验结果虽然易受多种因素影响，耗时费力，但却是最标准、最经典的血清抗体检测方法，也是OIE指定的试验检测方法之一。以上方法均可推荐使用，并且随着分子生物学技术的不断发展与革新，IBRV的检测方法会越来越具有高效、敏感、快速、特异的特点，能在IBR的控制和根除中起到重要作用，同时我国也应该制定更严格的进口检疫政策，及时实施免疫预防措施，并加强饲养管理，控制环境卫生，从而使养牛业向着更加健康的方向发展。