酶法催化酸解合成富含OPO的人乳替代脂

邹 硕，王笑寒，王小三，金青哲，王兴国

(江南大学 食品学院，江苏省食品安全与质量控制协同创新中心，江苏 无锡 214122)

对婴幼儿来说，母乳是生长发育过程中最理想的食物来源。乳脂肪作为母乳的重要成分之一，虽然仅占母乳的3%～5%，却能提供50%～60%的能量，也提供必需脂肪酸、脂溶性维生素和生物活性物质，是婴儿成长所需能量的主要来源[1]。乳脂肪中甘油三酯大部分都是USU结构(U不饱和，S饱和)，这与大部分植物油的构型显著不同[2]。大量文献证实，1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯(OPO)是典型的USU结构，在母乳中含量高，可以预防婴儿便秘，防止婴儿矿物质流失和为婴儿提供充足的能量[3-7]。乳脂肪进入婴儿体内后，首先在胃中被胃脂酶进行初步消化，10%～30%的甘油三酯在此过程中被消化。而后脂肪球经胃排空作用进入小肠，被胰脂酶水解成sn-2位单甘酯和游离脂肪酸[8]。sn-2位单甘酯能直接被小肠吸收，给婴儿供能。而游离脂肪酸若熔点高于人体体温，则容易在小肠的酸性环境下与钙、镁离子发生皂化反应，引起能量和钙丢失，导致婴儿产生便秘等不良反应[9]。考虑到棕榈酸熔点高于体温，因此在生产人乳替代脂时应使大部分棕榈酸在sn-2位，以避免上述情况发生。

由于我国婴幼儿纯母乳喂养率不断下降，婴幼儿奶粉消费量呈快速上升趋势，这给奶粉市场带来了巨大商机。而OPO作为母乳中重要的功能成分，是许多厂家致力于模拟的对象。文献中关于酶法合成OPO的报道很多，常见的原料有猪油、巴沙鲶鱼油和棕榈硬脂三大类。李昕倩等[10]以猪油和油酸为原料，选择Candidasp. 99-125脂肪酶作催化剂，在无溶剂体系下反应，产物中含有43%以上的OPO。黄磊等[11]以巴沙鲶鱼油和油酸为原料，Lipozyme RM IM脂肪酶作催化剂催化反应，产物中OPO含量达到34.28%。李世磊等[12]以52℃棕榈硬脂和油酸为原料，Lipozyme RM IM脂肪酶作催化剂催化反应，产物中OPO含量达45.23%。猪油虽然与母乳脂肪酸组成相似，分提后OPO含量也较高[13]，但无法通过HALAL清真认证，在推广上有一定局限性。巴沙鲶鱼油虽然原料丰富，但是产品中OPO含量较低，资源利用率较低。棕榈硬脂来源广泛，价格低廉，但在sn-2位上棕榈酸含量不够高，若想产品中得到含量更高的OPO，需对棕榈硬脂进行进一步处理。综上所述，目前市场上有关OPO的产品很多，但绝大部分产品中OPO含量都低于50%，纯度不足以满足市场的需求。为了得到纯度足够高的产品，本文从两方面着手：一方面对原料进行进一步处理，将棕榈硬脂分提，得到三棕榈酸甘油三酯(PPP)含量超过90%的棕榈硬脂——制备OPO的理想原料；另一方面对酶法催化酸解反应条件进行优化，以求在经济合理的情况下得到纯度更高的富含OPO的产品。

本文以棕榈硬脂和油酸为原料，酶法催化酸解合成富含OPO的人乳替代脂。首先对棕榈硬脂进行分提，得到PPP含量足够高的棕榈硬脂作为反应底物。再在无溶剂体系下，探究不同酶种类、反应时间、底物摩尔比、反应温度、脂肪酶用量对反应产物的影响，得到最优反应条件，最后采用高效液相色谱与气相色谱对反应产物的甘油三酯及sn-2位脂肪酸组成进行分析。

1 材料与方法

1.1 实验材料

58℃棕榈硬脂，东海粮油工业(张家港)有限公司；商业化油酸(纯度为89.6%)，Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司；固定化脂肪酶NS40086、Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM，诺维信(中国)投资有限公司；猪胰脂酶，Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司；TLC硅胶板60G(10 cm×20 cm)，烟台江友硅胶有限公司；正己烷、异丙醇和甲醇为色谱纯，百灵威科技有限公司；乙醚、胆酸钠、氯化钙、无水硫酸钠、氢氧化钾、冰醋酸和乙醚为分析纯，国药化学试剂上海有限公司。

AR2140电子精密天平，HH-4数显恒温水浴锅，RE-52旋转蒸发器，SHB-B95型循环水式多用真空泵，TGL-16B离心机，IKAHS 7加热磁力搅拌器，Agilent 7820A气相色谱仪，Agilent 1260高效液相色谱仪，ELSD 3300蒸发光散射检测器。

1.2 实验方法

1.2.1 棕榈硬脂的分提

将20 g棕榈硬脂与100 mL丙酮混合，在60℃下溶解，然后降温至38℃，养晶3 h，迅速分离得到固体部分，旋转蒸发得到富含PPP的棕榈硬脂。

1.2.2 OPO的合成

将富含PPP的棕榈硬脂和油酸按一定摩尔比混合，加入到密闭的容器中，加入一定量的脂肪酶，在一定温度下磁力搅拌反应一段时间后，离心沉降去除脂肪酶，再按质量体积比1∶10加入正己烷溶解，置于分液漏斗，加入0.5 mol/L的KOH-CH3CH2OH溶液，剧烈振荡，静置分层后取上层，再加入10倍体积的去离子水振荡，静置分层后取上层[14]，即为反应产物OPO。

1.2.3 高效液相色谱法分析甘油三酯组成

将样品溶于色谱纯正己烷中，配制成质量浓度为10 mg/mL的样品，过膜，采用配备有蒸发光散射检测器和Lichrospher C18色谱柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)的高效液相色谱仪进行分析。

色谱条件：柱温30℃；梯度洗脱条件为0～40 min 60%乙腈、40%异丙醇，45～85 min 55%乙腈、45%异丙醇，85～90 min 60%乙腈、40%异丙醇；洗脱流速0.8 mL/min；雾化室温度55℃；气体流速1.8 L/min；增益1。采用峰面积归一化法进行定量。

1.2.4 气相色谱法分析脂肪酸组成

1.2.4.1 分提产物脂肪酸分析

将分提产物根据GB 5009.168—2016和实验室方法进行甲酯化处理。取20 mg样品于5 mL离心管中，溶于1.5 mL正己烷，加入500 μL 2 mol/L的KOH-CH3OH溶液，振荡反应2 min。加入适量无水硫酸钠，振荡脱水。静置后吸取上清液，过0.22 μm有机滤膜后进行GC分析。将脂肪酸甲酯的保留时间同Supelco 37脂肪酸甲酯混标比较进行脂肪酸定性分析。采用面积归一化法进行各脂肪酸的定量。

1.2.4.2 反应产物sn-2位脂肪酸分析

反应产物的水解产物2-MAG的制备按照GB/T 24894—2010进行。取50 mg样品于15 mL离心管，依次加入0.7 mL氯化钙溶液、1.25 mL胆酸钠溶液和7 mL Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)，再加入30 mg猪胰脂酶，振荡1 min。置于37℃水浴振荡3 min，取出后振荡30 s，重复两次，最后一次水浴时间缩短为2 min。取出后在流动的冷水下冷却，加入2 mL乙醚振荡，离心(4 000 r/min，3 min)后取上清液，氮吹至近干浓缩。将浓缩液点样在硅胶板上，展开剂为正己烷-乙醚-乙酸(体积比为50∶50∶1)。将2-MAG的条带刮下，用乙醚提取，氮吹除去乙醚得2-MAG。根据GB 5009.168—2016甲酯化方法处理，取10 mg上述2-MAG 于1.5 mL离心管中，溶于700 μL正己烷，加入375 μL 2 mol/L的KOH-CH3OH溶液，振荡反应2 min。加入无水硫酸钠，振荡脱水。静置后吸取上清液，过膜进行GC分析。脂肪酸定性定量方法同1.2.4.1。

1.2.4.3 气相色谱分析条件

采用配备火焰离子化检测器的Agilent 7820A气相色谱仪进行分析，分析柱为Trace Tr-Fame(60 m×0.25 mm×0.25 μm)。升温程序为：60℃保留3 min，5℃/min升温至180℃，保留15 min，最终以2℃/min升温至220℃。

2 结果与讨论

2.1 反应底物分析

分提后的棕榈硬脂的甘油三酯及脂肪酸组成分析结果如表1、表2所示。

表1 分提后的棕榈硬脂甘油三酯组成

表2 分提后的棕榈硬脂脂肪酸组成 %

从表1、表2可以看出，分提后的棕榈硬脂中PPP含量达到了92.32%，棕榈酸含量也高于90%，是制备高含量OPO的理想原料。原料油酸的纯度为89.6%，可作为良好的酰基供体。因此，以分提后的棕榈硬脂与高纯度油酸为原料，制备富含OPO的人乳替代脂，是一条经济实用的技术路线。

2.2 单因素实验

2.2.1 脂肪酶种类的影响

将富含PPP的棕榈硬脂和油酸以底物摩尔比1∶8混合，分别加入占底物总质量10%的固定化脂肪酶NS40086、Lipozyme RM IM和Lipozyme TL IM，在60℃下反应4 h，反应结束后取样检测，结果如图1所示。

图1 脂肪酶种类对OPO含量、sn-2位棕榈酸含量的影响

从图1可以看出，使用3种脂肪酶分别催化反应时，产物中sn-2位棕榈酸含量均稳定保持在80%以上，而使用脂肪酶NS40086时，产物中OPO含量最高。因此，选择脂肪酶NS40086作为进一步研究的条件。

2.2.2 反应时间的影响

将富含PPP的棕榈硬脂和油酸以底物摩尔比1∶8混合，脂肪酶NS40086用量为底物总质量的10%，反应温度60℃，反应过程中每小时间隔取样检测，结果如图2所示。

图2 反应时间对OPO含量、sn-2位棕榈酸含量的影响

从图2可以看出，随着反应的进行，产物中OPO含量逐渐上升，当反应时间为4 h时，OPO含量达到67.21%。反应时间超过4 h后，OPO含量趋于稳定。这说明酸解反应经过4 h后达到平衡。产物中sn-2位棕榈酸含量随着反应时间的延长而下降，表明反应过程中出现了酰基转移，并且反应时间延长对酰基转移有促进作用。体系中酰基转移量越多，会降低反应产物的纯度，增加副产物。考虑到原料成本及以上情况，选择4 h作为进一步研究的条件。

2.2.3 底物摩尔比的影响

保持其他反应条件不变，将富含PPP的棕榈硬脂和油酸以1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15不同摩尔比混合，反应结束后取样检测，结果如图3所示。

图3 底物摩尔比对OPO含量、sn-2位棕榈酸含量的影响

酶催化的酸解反应是可逆反应，较高的底物摩尔比有利于平衡向正反应方向移动，但也会为后续的脱酸带来困难，同时增加了经济成本。从图3可以看出：当底物摩尔比由1∶8增加至1∶10时，产物中OPO含量由60.45%增加至68.29%，增加7.84个百分点；当底物摩尔比由1∶10增加至1∶12时，产物中OPO含量增加4.24个百分点；而当底物摩尔比由1∶12增加至1∶15时，产物中OPO含量增加3.64个百分点。这说明产物中OPO增加量随着底物摩尔比的增加而不断降低。同时产物中sn-2位棕榈酸含量随着底物摩尔比的增加逐渐降低，表明底物中较高的游离脂肪酸含量对酰基转移有促进作用。综合以上分析，选择底物摩尔比1∶10作为进一步研究的条件。

2.2.4 酶用量的影响

保持其他反应条件不变，分别加入占底物总质量6%、8%、10%、12%、15%的脂肪酶NS40086，反应结束后取样检测，结果如图4所示。

从图4可以看出，产物中OPO含量随着酶用量的增加而不断增加。但从另一方面考虑，产物中sn-2位棕榈酸含量随着酶用量的增加而不断下降，直到酶用量为12%时，sn-2位棕榈酸含量基本保持稳定。这表明高酶用量也会导致酰基转移增加，但在酶用量高于12%后，酰基转移现象基本不再增加。当酶用量由8%增加至12%时，产物中OPO含量增加较快，当酶用量由12%增加至15%时，产物中OPO含量增加较少，明显低于前者。考虑到经济成本问题，综合上述情况，选择酶用量12%作为进一步研究的条件。

图4 酶用量对OPO含量、sn-2位棕榈酸含量的影响

2.2.5 反应温度的影响

保持其他反应条件不变，分别在55、60、65℃下反应，反应结束后取样检测，结果如图5所示。

图5 反应温度对OPO含量、sn-2位棕榈酸含量的影响

较高的温度可以提高反应速率，从而缩短反应达到平衡所需的时间，但是相应也会增加酰基转移的速率，降低反应产物的纯度。从图5可以看出，当反应温度由55℃上升至65℃过程中，sn-2位棕榈酸的含量稳定保持在80%以上，而在60℃时，产物中OPO含量最大。因此，为了在反应效率较高的同时降低酰基转移量，选择最佳反应温度为60℃。

综上所述，酶法催化酸解合成富含OPO人乳替代脂的优化条件为：反应时间4 h，底物摩尔比1∶10，反应温度60℃，脂肪酶NS40086用量12%。

2.3 与市售人乳替代脂的比较

Infat作为市场占有率最高的人乳替代脂之一，将本文优化条件下合成的产品与其进行比较，结果如表3、表4所示。

表3 本产品和Infat的甘油三酯组成 %

表4 本产品和Infat的sn-2位脂肪酸组成 %

由表3、表4可知，在优化条件下，酶催化酸解产物的OPO含量可达72.53%，sn-2位棕榈酸含量为87.03%。而市售人乳替代脂Infat中的OPO含量与sn-2位棕榈酸含量分别为21.21%、26.68%，远低于本产品。

3 结 论

本文以富含PPP的棕榈硬脂和油酸为原料，通过酶法催化酸解反应制备富含OPO的人乳替代脂。结果表明，酶法酸解反应的优化条件为：反应时间4 h，底物摩尔比1∶10，反应温度60℃，脂肪酶NS40086用量12%。在优化条件下，所得产品的OPO含量可达72.53%，sn-2位棕榈酸含量为87.03%，高于市售同类产品Infat的OPO含量。值得一提的是，高效液相色谱分离同分异构体十分困难，现阶段研究难以仅通过高效液相色谱分析出sn-OPO的含量，须用气相色谱加以辅助判断，耗费时间的同时增加了工作量。如何去除这些和目标产物熔沸点相似的甘油三酯，得到只有OPO的甘油三酯，目前仍未有有效的解决方法，需要进一步的研究。