菌丝霉素对生长育肥猪生长性能、血清生化指标和肠道健康的影响

2020-01-16马景林孙丹丹李峰娟张梦玲黄柳英张建云马秋刚赵丽红

中国畜牧杂志 2020年1期

张静，马景林，孙丹丹，李峰娟，张梦玲，黄柳英，张建云，马秋刚，计成，赵丽红*

（1.动物营养学国家重点实验室，中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193；2.广东海纳川生物科技股份有限公司，广东广州 510275；3.福建丰泽农牧饲料有限公司，福建福州 350007）

抗生素在畜禽养殖中发挥了非常重要的作用，但随之产生的耐药性以及抗生素残留问题愈发突出[1]。因此，寻找高效和安全的抗生素替代品迫在眉睫。

抗菌肽作为一类广泛存在于自然界中的小分子肽类物质，是动物机体先天免疫的重要组成成分。抗菌肽具有广谱抗菌活性以及不易产生耐药性等特点[2]，近年来被认为是极具潜力的抗生素替代品。研究表明，抗菌肽PR39、乳铁蛋白、天蚕素、防御素及菌丝霉素能够提高断奶仔猪的生长性能，增强免疫力[3-5]。菌丝霉素作为一种真菌防御素，能够有效抑制革兰氏阳性致病菌的生长繁殖，且能够在毕赤酵母中高效表达[6]。Ma 等[7]研究表明，菌丝霉素对肉鸡生长性能、肠道健康及先天免疫具有有益的作用。李延等[5]研究发现，在断奶仔猪日粮中添加0.2%重组菌丝霉素能够改善仔猪的生长性能。本试验旨在探究菌丝霉素对生长育肥猪的生长性能、肠道健康以及血清抗氧化指标的作用效果，为其在生猪生产上的推广应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料试验用菌丝霉素由广东海纳川生物科技股份有限公司提供，含有40 个氨基酸（GFGCNGPWD EDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCX），分子量约为4.4 ku，纯化后的菌丝霉素纯度大于95%。由菌丝霉素制成的抗菌肽产品普乐特，其菌丝霉素含量为2%；吉他霉素预混剂的有效成分含量为50%。参照Ma 等[7]方法制备菌丝霉素，将来自腐生子囊菌的菌丝霉素基因克隆至载体pPICZαA 中以构建重组质粒，通过电转将重组质粒转入毕赤酵母中，并将阳性转化子在10 mL 含100 μg/mL 博来霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）培养基中培养，30℃，250 r/min 培养24 h。之后将阳性转化子在4℃，4 000 r/min 条件下离心5 min，弃上清液，用1 L YPD 培养基重悬菌体。最后，通过高密度发酵在含基础盐培养基（BSM）的2 t 发酵罐中制备重组菌丝霉素，其中溶氧量保持在30% 以上。先把培养基中原有的碳源消耗掉，再加甲醇37℃诱导表达72 h，上清液总蛋白浓度为4 g/L。离心去除酵母细胞，将发酵液上清浓缩后，经离子交换层析纯化，即可得重组菌丝霉素。

1.2 试验设计及日粮试验采用单因素完全随机化设计。选取44 头90 日龄、平均体重为（43.51±0.56）kg的长× 大二元生长母猪随机分为4 个处理，每个处理11 个重复，每个重复1 头猪，各处理间猪的初始体重差异不显著。负对照组（NC 组）饲喂基础日粮，基础日粮按照NRC（1998）猪营养需要标准配制，其原料组成和营养成分见表1；正对照组（PC 组）在基础日粮中添加30 mg/kg 吉他霉素；菌丝霉素低剂量组（LPle组）和高剂量组（HPle 组）分别在基础日粮添加100、200 mg/kg 菌丝霉素，试验期70 d。

表1 基础日粮组成和营养成分（风干基础）

1.3 饲养管理试验猪采用全自动饲喂系统自由采食，每个处理在同一栏，试验猪有电子耳号，进入系统的采食仓后，系统自动识别耳号，并记录采食前的料重，退出采食仓后，再次记录料重，两者之差为本次采食量，并且记录试验猪的体重。当料槽重量小于设定的最小值时系统自动加料。每个栏中配有鸭嘴式饮水器，猪自由饮水。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 生长性能分别于试验第1 天（90 日龄）和2 个阶段的最后1 天（128 日龄和159 日龄）记录每头猪的体重，全自动饲喂系统自动记录每头猪每天的耗料量，计算各阶段的平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）和耗料增重比（F/G）。

1.4.2 血清生化指标及抗氧化指标测定于试验第70天，每个处理随机选取6 头接近该处理平均体重的猪，前腔静脉采血10 mL，静置30 min 后，于4℃，3 000 r/min条件下离心15 min 分离血清，用Eppendorf 管分装后放入-20℃保存。使用日立7600 全自动生化分析仪测定血清中总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、尿素（UREA）和碱性磷酸酶（ALP）含量；采用免疫比浊法测定血清中免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）和免疫球蛋白M（IgM）含量，试剂盒由南京建成生物功能研究所提供；总超氧化物歧化酶（T-SOD）、总抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）以及溶菌酶（LZM）的测定所用试剂盒购自南京建成生物功能研究所，具体操作步骤严格按照说明书进行。

1.4.3 十二指肠肠绒毛形态观察在试验第70 天，提前1 d 晚上给猪结料，空腹12 h，每处理随机选取4 头猪处死后迅速打开腹腔，结扎各个肠段，取十二指肠肠管约2 cm，用PBS 缓冲液冲洗后放入4% 多聚甲醛固定，之后进行脱水、石蜡包埋、切片及HE 染色。使用显微镜观察HE 染色后的肠道组织切片，用VENTANA Image Viewer 软件随机选取5 根完整绒毛测量其绒毛高度和隐窝深度，计算绒毛高度与隐窝深度比值，取平均值用于数据统计分析。绒毛长度是指绒毛顶端到隐窝开口的长度，隐窝深度是指肠腺底部到两绒毛之间基部开口处的距离。

1.4.4 肠道酶活分别取5 g 结肠、回肠食糜放入无菌离心管中，按1:4 的比例加入预冷的生理盐水后充分匀浆，4℃，2 500 r/min 离心10 min，取上清液存放于-20℃待测。采用碘-淀粉法测定淀粉酶活力；采用化学比浊法测定脂肪酶活性；用比色法测定胰蛋白酶和糜蛋白酶活性，测定所用试剂盒购自南京建成生物功能研究所。

1.5 统计分析试验数据经Excel 2016 处理后，采用SPSS 21.0 软件的单因素ANOVA 程序进行显著性分析，用 Duncan´s 法进行组间的多重比较，以P＜0.05 作为差异显著性判断标准，试验结果以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 菌丝霉素对生长育肥猪生长性能的影响由表2 可知，在整个试验期，吉他霉素和菌丝霉素对试验猪的末体重、ADG、ADFI 和F/G 均无显著影响。

2.2 菌丝霉素对生长育肥猪血清生化指标的影响由表3 可知，HPle 组猪的血清ALP、IgA、IgG、IgM 和LZM 含量均高于其他3 组（P＜0.05），但NC 组、PC 组、LPle 组间差异均不显著。各组间猪的血清TP、ALB 和UREA 含量差异均不显著，但HPle 组TP 和ALB 含量均为最高。相较于NC 组，HPle 组猪的血清IgA、IgG、IgM 含量分别提高了29.41%、10.06%和24.64%（P＜0.05）。相较于PC 组，HPle 组猪的血清IgA、IgG、IgM 含量分别提高了20.88%、15.16%和26.47%（P＜0.05）。

2.3 菌丝霉素对生长育肥猪血清抗氧化指标的影响由表4 可知，HPle 组猪的血清T-SOD 和T-AOC 含量均高于NC 组（P＜0.05），NC 组、PC 组、LPle 组间差异不显著。与NC 组相比，HPle 组猪的血清MDA 含量显著降低。各组间血清中GSH 的含量无显著差异。

2.4 菌丝霉素对生长育肥猪十二指肠形态的影响由表5 可知，相较于NC 组，LPle 组和HPle 组猪的十二指肠绒毛高度分别提高了54.29%和37.49%（P＜0.05）；相较于PC 组，LPle 组和HPle 组猪的十二指肠绒毛高度分别提高41.78%和26.34%（P＜0.05）。除LPle 组外，其他各组间猪的隐窝深度差异不显著。与NC 组相比，PC 组、LPle 组和HPle 组未见对十二指肠绒毛高度/隐窝深度产生显著影响。

表2 菌丝霉素对生长育肥猪生长性能的影响（n=11）

表3 菌丝霉素对生长育肥猪血清生化指标的影响（n=6）

2.5 菌丝霉素对生长育肥猪回肠和结肠消化酶活性的影响由表6 可知，与NC 组相比，LPle 组猪的回肠胰蛋白酶活性显著提高，LPle 组和HPle 组猪的回肠淀粉酶活性均有升高的趋势（P=0.09）；与PC 组相比，LPle 组、HPle 组以及NC 组猪的结肠淀粉酶活性显著提高，其余各组间回肠和结肠的消化酶活性无显著差异。

3 讨论

3.1 菌丝霉素对生长育肥猪生长性能的影响许多研究表明，饲粮中添加抗菌肽能够促进猪的生长[4,8-9]，但有关菌丝霉素在生长育肥猪生产中应用效果的研究很少。本试验结果表明，与不添加抗生素组相比，饲粮中添加100 mg/kg 和200 mg/kg 菌丝霉素增加了猪的末体重，F/G 有降低趋势。宦海琳等[10]研究表明，饲粮中添加天蚕素抗菌肽CAD 能够一定程度上提高仔猪ADG、ADFI，降低F/G，但差异均不显著。Xiong 等[3]报道，饲粮中添加复合抗菌肽能够显著提高断奶仔猪的ADG和ADFI，并且显著降低F/G。侯改凤等[9]发现，饲料中添加50 mg/kg 抗菌肽制剂显著提高了育肥猪ADG 及饲料转化率，促进了育肥猪生长。李延等[5]研究表明，与对照组相比，抗菌肽（重组菌丝霉素）组能够显著提高断奶仔猪ADFI 和ADG，显著降低F/G，并且菌丝霉素对生长性能的促进作用与抗生素效果类似。本试验中，菌丝霉素组猪的生长性能相较于对照组有提高的趋势，可能是各处理样本数量较少，组内差异相对较大，掩盖了组间差异。

3.2 菌丝霉素对生长育肥猪血清生化指标的影响血清生化指标可反映动物机体的代谢情况，并且血清生化指标与机体的营养状况以及疾病有着密切联系。临床上，ALP、谷草转氨酶（AST）、ALB 以及UREA 含量是反映肝脏、胰腺以及肾脏功能的重要指标[11]；TP 和ALB 含量则反映机体蛋白和氨基酸的吸收代谢情况。本试验中，饲粮中添加菌丝霉素能一定程度上提高ALP含量，各组间血清TP、ALB 和UREA 含量差异不显著，表明各组猪的机体代谢功能相近且无异常。IgA、IgG 和IgM 是广泛存在于动物机体内参与体液免疫反应的球蛋白，IgA 和IgG 具有抗病毒、抑真菌等免疫活性，IgM 具有激活补体等作用[4]。动物血清中免疫球蛋白含量的变化与其健康状态、生长状况密切相关。溶菌酶由巨噬细胞合成并快速释放，作用于细菌细胞壁可水解其中的黏多糖，导致细菌裂解死亡，从而发挥杀菌作用。卢俊鑫等[4]研究表明，饲粮中添加天蚕素可以提高血清中IgG 和IgM 含量，添加抗菌肽PR39 可显著增加血清中IgG 含量。在肉仔鸡饲粮中添加抗菌肽可显著提高血清中IgA 含量[12]。本试验中，与不添加抗生素组和吉他霉素组相比，饲料中添加菌丝霉素提高了血清中IgA、IgG 和IgM 含量，增强了体液免疫反应。范少本[13]研究表明，小肽类物质进入动物体内后形成与氨基酸合成有关的谷氨酰胺、α-酮戊二酸等重要中间代谢产物，而谷氨酰胺在动物体内通过脱氨基或转氨基作用合成多种非必需氨基酸，参与并促进体内免疫球蛋白的合成。而血清中TP、ALB 含量增加说明机体蛋白质吸收、合成和代谢功能加强，而机体蛋白质的增加可为免疫球蛋白合成提供原料，这在一定程度上也反映了机体免疫力的增强。抗生素在杀死体内病原菌的同时也会杀死有益菌，并且可进入动物体内的血液循环系统，对免疫系统造成一定的不良影响。

表4 菌丝霉素对生长育肥猪血清抗氧化指标的影响（n=6）

表5 菌丝霉素对生长育肥猪十二指肠形态的影响（n=4）

表6 菌丝霉素对生长育肥猪回肠和结肠酶活的影响（n=4）

3.3 菌丝霉素对生长育肥猪血清抗氧化指标的影响机体在代谢过程中会产生活性氧自由基（ROS）。正常生理状态下，动物体内活性氧的产生和清除处于动态平衡之中，氧自由基的清除机制主要分为酶促和非酶促两类。酶促系统包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和过氧化物酶（POD）[14]。非酶促系统包括抗坏血酸（VC）、谷胱甘肽、维生素E、类胡萝卜素等，T-AOC 可从总体上反映机体防御系统抗氧化能力的高低，从而体现机体的健康状况[15]。MDA 是机体内ROS 攻击生物膜中多不饱和脂肪酸产生的脂质过氧化产物的分解产物，具有细胞毒性，其含量可显示机体内脂质过氧化的程度，从而间接地反映细胞氧化损伤的严重性[16]。但启雄等[17]研究发现，在基础日粮中添加不同浓度复合抗菌肽可显著提高断奶仔猪血清中T-SOD、GSH-Px 活力和T-AOC水平，且MDA 含量显著降低。本试验中，饲粮中添加菌丝霉素能够提高血清T-SOD、T-AOC 含量，说明菌丝霉素能够提高生长育肥猪的抗氧化能力，减少氧化应激，MDA 含量的减少表明菌丝霉素可保护细胞膜结构的完整性，减弱动物机体的氧化损伤[17]。目前关于菌丝霉素对猪血清抗氧化机理的报道较少，其发挥作用的机制可能是菌丝霉素的氨基酸残基可与机体内阳离子结合或者抑制氢离子的释放，延缓脂质过氧化反应，从而发挥抗氧化作用[18]；与此同时，菌丝霉素中谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp）残基可螯合金属离子，降低机体内氧化反应速度[13]。

3.4 菌丝霉素对生长育肥猪十二指肠形态的影响小肠是消化道内营养物质消化和吸收的主要部位，其功能单位是绒毛，肠黏膜表面有无数绒毛（长度约为300～500 μm），从而极大地增加了肠道吸收营养物质的面积[19]。小肠的绒毛高度、隐窝深度以及绒毛高度/隐窝深度都是衡量小肠消化吸收功能以及肠黏膜结构形态完整性的重要指标[20]。绒毛高度/隐窝深度综合反映了肠黏膜结构形态的完整性，比值增大说明小肠消化吸收能力增强；比值下降则表明黏膜受损，消化吸收功能下降。本试验中，在饲粮中添加菌丝霉素均能提高十二指肠绒毛高度，并且在一定程度上提高其绒毛高度/隐窝深度，这与马卫明等[21]和宦海琳等[10]报道的抗菌肽能够提高十二指肠绒毛高度的结果吻合。LPle 组的十二指肠隐窝深度变深，这与宦海琳等[10]报道的抗菌肽能够降低隐窝深度的结果相反；但李延[22]研究表明，添加菌丝霉素对断奶仔猪十二指肠隐窝深度没有影响。造成这种差异的原因可能是低剂量菌丝霉素对猪的作用效果没有高剂量菌丝霉素显著。抗菌肽能够通过抑制有害菌的生长，减少内毒素的产生及肠道有害菌对其肠黏膜的破坏作用，同时还可促进有益菌的生长，维持肠道健康的微生物区系，从而有效改善生长育肥猪十二指肠的肠黏膜形态结构。吉他霉素组可降低肠道有害菌数量，但同时也会杀害有益菌，因此吉他霉素能够提高生长育肥猪的绒毛高度，但效果不如菌丝霉素。

3.5 菌丝霉素对生长育肥猪回肠和结肠消化酶活性的影响肠道内消化酶主要起吸收和消化营养物质的功能[23]。消化酶活性的升高有利于促进营养物质在体内的消化利用。Wan 等[24]发现，在断奶仔猪日粮中添加菌丝霉素能够刺激并促进双糖酶等消化酶的分泌。本试验获得了与其相似的结果，在饲粮中添加菌丝霉素能显著提高回肠胰蛋白酶和结肠淀粉酶的活性，且具有提高回肠淀粉酶活性的趋势，但吉他霉素对其消化酶活性没有影响。消化酶活性的提高表明猪的吸收能力增强，饲喂菌丝霉素的猪的吸收能力增强很有可能与菌丝霉素提高肠绒毛高度和绒毛高度/ 隐窝深度有关[25]。综上所述，在饲料中添加菌丝霉素能够提高生长育肥猪肠道消化酶的活性，促进其对营养物质的消化吸收。