高效液相色谱法测定苯甲醛-2,4-二磺酸钠的含量

李 刚

(辽东学院 化工与机械学院，辽宁 丹东 118003)

苯甲醛-2,4-二磺酸钠,又名4-苯甲醛-1,3-二磺酸二钠盐，CAS登记号：33513-44-9，用于合成荧光增白剂[1]、测定细胞脱氢酶活性试剂[2]以及细胞增殖和细胞毒性试验试剂盒中水溶性四氮唑盐[3]的合成原料。文献报道的对于该化合物测定方法[4]是先利用亚硫酸氢钠饱和溶液与醛基发生加成反应，再将反应产物与碳酸氢钠共热又释放出结合的亚硫酸氢钠，最后用碘量法进行滴定分析；或是利用盐酸羟胺与醛基反应生成醛肟并释放出盐酸，再用碱标准溶液进行滴定分析。上述测定方法都属于化学滴定分析方法，存在操作繁琐、分析时间长、灵敏度低、复性差等不足。笔者利用高效液相色谱法，采用C18色谱柱，以甲醇/pH为3的磷酸二氢钾溶液=20/80(V/V)为流动相，紫外检测波长254nm，外标法测定苯甲醛-2,4-二磺酸钠的含量，结果表明，苯甲醛-2,4-二磺酸钠的进样质量浓度在10～320μg/mL范围内，峰面积与样品浓度呈良好的线性关系，相关系数r=0.9994，相对标准偏差为0.23% ，回收率为96.13%～100.23%。本方法具有测定速度快、灵敏度高、重现性好等优点。测得样品中苯甲醛-2,4-二磺酸钠的含量为83.1%。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Waters 1525二元泵，Waters 2489紫外可见光检测器，Waters Breeze2色谱工作站，美国沃特世公司；7725i手动进样阀，美国Rheodyne公司；紫外可见光分光光度计：UV2201型，日本岛津公司；数控超声波清洗器：KQ2200DA型，昆山市超声仪器有限公司。

苯甲醛-2,4-二磺酸钠标准品(质量分数为≥98.0%，Lot: E1525075 ，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；苯甲醛-2,4-二磺酸钠样品(工业品)；甲醇(HPLC级)；磷酸二氢钾(分析纯)。

0.050 mol/L磷酸二氢钾溶液(pH=3)：准确称取磷酸二氢钾固体13.6 g，用少量水溶解后，定容至2 L，再滴加磷酸调节pH值为3。

二次重蒸馏水：自制。

1.2 色谱条件[5-6]

色谱柱：美国沃特世公司SunFireTMC18柱(4.6×250 mm，5 μm)，柱温30 ℃，流动相： 甲醇/pH为3的0.050 mol/L磷酸二氢钾溶液=20 /80(V/V)，流动相使用之前用0.45 μm滤膜过滤，流速为1.0 mL/min，紫外检测波长254 nm。进样体积5 μL。

1.3 试验方法

1.3.1 标准品溶液的配制

苯甲醛-2,4-二磺酸钠标准品溶液：精密称取0.1 g(精确到0.000 1 g)苯甲醛-2,4-二磺酸钠标准品于100 mL容量瓶中，以流动相定容,得到1 mg/mL标准品储备液。取上述储备液5 mL于50 mL容量瓶中，以流动相定容后，得到0.1 mg/mL的标准品溶液。

1.3.2 样品溶液的配制

苯甲醛-2，4-二磺酸钠样品溶液：精密称取0.1 g(精确到0.000 1 g)苯甲醛-2,4-二磺酸钠工业品样品于100 mL容量瓶中，以流动相定容,得到1 mg/mL样品储备液。取上述储备液5 mL于50 mL容量瓶中，以流动相定容后，得到0.1 mg/mL的样品溶液。

1.3.3 测定

待色谱仪器稳定后，分别取标准品和样品溶液5 μL进样，重复操作，保证其相对标准偏差小于0.5%，记录色谱峰的峰面积数据，根据外标法定量计算出苯甲醛-2,4-二磺酸钠的含量。

1.3.4 分析结果的表述

苯甲醛-2,4-二磺酸钠的含量用质量分数表示，质量分数按式(1)计算：

(1)

样品中苯甲醛-2,4-二磺酸钠的质量分数ω1，以%表示。

式中：

A1——样品溶液中，苯甲醛-2,4-二磺酸钠的峰面积值，单位为微伏·秒/μv·s；

A2——标准品溶液中，苯甲醛-2,4-二磺酸钠的峰面积值，单位为微伏·秒/μv·s；

m1——苯甲醛-2,4-二磺酸钠标准品的质量，单位为克/g；

m2——苯甲醛-2,4-二磺酸钠样品的质量，单位为克/g；

ω——标准品中苯甲醛-2,4-二磺酸钠的质量分数，以%表示。

1.3.5 色谱图

按1.2中的色谱条件，分别对苯甲醛-2,4-二磺酸钠标准品溶液和样品溶液进样分析，测得标准品和样品溶液的色谱保留时间tR为5.769 min和5.770 min，对应的色谱图见图1和图2。

2 结果与讨论

2.1 流动相以及流动相离子强度的选择

本试验比较了甲醇/水、甲醇/磷酸水溶液、甲醇/磷酸二氢钾溶液的三种流动相体系，由于苯甲醛-2,4-二磺酸钠属于离子型化合物，当采用甲醇/水、甲醇/磷酸水溶液体系时，在C18色谱柱上不易保留，出峰时间过快。以甲醇/pH为3的磷酸二氢钾溶液(V/V为20/80)作为流动相，并在固定其它实验条件不变情况下,分别试验比较了甲醇和0.025、0.050、0.075 mol/L三种不同摩尔浓度的磷酸二氢钾溶液所组成流动相时的色谱分离效果。结果表明，当磷酸盐的摩尔浓度为0.05 mol/L时,色谱分离效果最佳。因此实验选择甲醇/pH为3的0.050 mol/L磷酸二氢钾溶液=20 /80(V/V)作为流动相进行色谱分析。

2.2 色谱柱柱温的选择

当柱温从20 ℃上升到40 ℃时，分离效果变化不大，从色谱柱的柱压力、分离效果和实际操作等因素方面考虑，实验选择柱温为30 ℃。

2.3 紫外检测波长的选择

以流动相作为参比，利用紫外可见光分光光度计在200～350 nm范围内，对苯甲醛-2,4-二磺酸钠标准品溶液进行扫描，结果表明苯甲醛-2,4-二磺酸钠在215和254 nm处有较强的紫外吸收，为最大程度减少流动相的背景吸收干扰和保证样品检测灵敏度，实验选择紫外检测波长为254 nm。

2.4 检出限

苯甲醛-2,4-二磺酸钠标准品溶液经多次稀释后，进样进行色谱分析。选择合适的基线噪音范围，根据信噪比S/N=3时，计算出仪器的最低检出限为0.1 μg/mL；信噪比S/N=10时，计算出仪器的定量限为 0.3 μg/mL。

2.5 线性方程与线性范围

将苯甲醛-2,4-二磺酸钠标准品储备液配制成浓度为10、20、40、80、160、320 μg/mL系列标准品溶液，按1.2中的色谱条件进行测定，对苯甲醛-2,4-二磺酸钠的峰面积和浓度进行线性回归处理，得线性方程为y=9 190.1x+27 752,线性相关系数r=0.999 4。峰面积(y)与浓度(x)对应关系如图3所示。由图3可知，进样浓度在 10～320 μg/mL范围内，苯甲醛-2,4-二磺酸钠的峰面积与样品浓度呈良好的线性关系。

2.6 精密度试验

依照1.2中的色谱条件，用80 μg/mL的苯甲醛-2，4-二磺酸钠标准品溶液连续重复5次进样分析，所得结果见表1。由表1可知，苯甲醛-2，4-二磺酸钠含量的测试结果相对偏差(RSD)为0.23%。说明方法的精密度较高。

表1 苯甲醛-2，4-二磺酸钠的精密度试验(n=5)

2.7 回收试验

精密量取0.1 mg/mL苯甲醛-2，4-二磺酸钠样品溶液25 mL 3份，分别置于3只25 mL容量瓶中，各加入0.05、0.10、0.15 mg/mL苯甲醛-2，4-二磺酸钠标准品溶液1.0 mL，在同样条件下，每个样品重复测定5次，进行定量分析。所得结果见表2。由表2可知，加标回收率为96.13%～100.23%，说明方法的准确度较高。

表2 苯甲醛-2，4-二磺酸钠回收率测定

2.8 样品测定

在1.2中的色谱条件下,对工业品苯甲醛-2，4-二磺酸钠样品中苯甲醛-2，4-二磺酸钠的含量进行了5次测定，结果见表3，测定的精密度符合定量分析要求。

表3 工业品苯甲醛-2，4-二磺酸钠的含量测定

3 结论

利用高效液相色谱法对苯甲醛-2,4-二磺酸钠的含量进行了测定。结果表明，甲醛-2,4-二磺酸钠的进样浓度在10～320 μg/mL范围内，峰面积与样品浓度呈良好的线性关系，相关系数r=0.999 4，相对标准偏差为0.23%，回收率为96.13%～100.23%。本方法具有测定速度快、准确性、重现性好等优点。测得样品中苯甲醛-2,4-二磺酸钠的含量为83.1%。