基于Fosmid 文库平台快速构建PRV、PCV-2 和CSFV多联疫苗及其应用研究

随着集约化、高密度养殖的迅速发展，生猪养殖遭受各种传染病暴发的困扰，严重影响了养猪业的发展。其中猪伪狂犬病、猪瘟和猪圆环病毒病是危害养猪业健康发展的主要疾病，三者在临床中常常混合感染，给养猪业造成巨大的经济损失。我国广泛采用疫苗接种的方法来控制上述传染病，为了降低免疫成本、减少免疫次数，研制“一针防多病”的多联疫苗显得格外重要。其中利用活病毒载体构建同时表达多种抗原蛋白的多联疫苗是抵抗传染病混合感染的有效策略。研究证实，猪瘟病毒（CSFV）囊膜糖蛋白E2 和猪圆环病毒2 型（PCV-2）衣壳蛋白Cap 是其主要的抗原蛋白，而猪伪狂犬病病毒（PRV）gE/gI/TK 基因缺失疫苗安全性能高，能够提供完全保护，因此，利用基因缺失PRV 开发多联活病毒载体疫苗具有良好的应用前景。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所仇华吉研究员团队在前期研究中建立了一种高效、灵活的基于Fosmid 文库的遗传操作平台用于快速构建重组PRV，为开展PRV 活载体疫苗奠定了基础。

近期仇华吉研究团队在《Pathogens》上发表了题为“Generation and immunogenicity of a recombinant pseudorabies virus co-expressing classical swine fever virus E2 protein and porcine circovirus type 2 capsid protein based on fosmid library platform”的研究论文，该研究以其团队前期建立的能够快速构建PRV 突变体的Fosmid 文库平台为基础，构建了表达CSFV E2 蛋白和PCV-2 衣壳蛋白的重组PRV，并进行了免疫原性评价。

该研究首先利用Fosmid 文库平台构建了共表达CSFV E2 蛋白和PCV-2 Cap 蛋白的gE/gI/TK 三基因缺失重组PRV，采用间接免疫荧光技术和免疫印迹法验证E2 和Cap 蛋白可在PK-15 细胞上高水平表达。重组病毒rPRVTJ-delgE/gI/TK-E2-Cap 在pK-15细胞上传代20 代后，其生长曲线与亲本病毒rPRVTJ-delgE/gI/TK 无明显差别，说明基因缺失和外源基因的插入对PRV 病毒粒子的形成和增殖能力无影响。分别以P5、P10、P15 和P20 代病毒的基因组为模板，PCR 扩增验证gE/gI/TK 基因的缺失及外源基因E2 和Cap 的存在，结果表明该重组病毒具有良好的遗传稳定性。在家兔和猪体的免疫评价结果表明，rPRVTJ-delgE/gI/TK-E2-Cap 对家兔和猪是安全的，没有引起任何PRV 特异性的临床症状，且从免疫后家兔和猪只的血清中均能检测出抗PRV 的抗体。然而，该重组病毒免疫后未能检测到抗CSFV和PCV-2 的抗体，这可能是由于插入外源基因的位置不合适，或E2 和Cap 蛋白的表达量太低不足以诱导产生抗体，其具体原因有待进一步研究。

本研究采用的Fosmid 文库构建方法为PRV 病毒活载体疫苗的开发提供了一个关键技术平台，获得的重组病毒rPRVTJ-delgE/gI/TK-E2-Cap 经进一步的优化设计后，有望作为一种新的三价候选疫苗用以对抗PRV、CSFV 和PCV-2 混合感染。同时本研究采用的策略为猪传染病多联疫苗的研制提供了新的思路。