甾体衍生物羟基化的生物转化研究进展

苏海林(云南经济管理学院医学院药学系，云南 昆明 650200)

0 引言

近几年来，人们对于甾体化合物的研究越来越广泛，由于甾体化合物本身的特性使其在多方面均得到了应用，例如在治疗淋巴母细胞白血病，治疗内分泌紊乱等相关疾病以及进行人体器官移植时等均取得了较好的治疗进展。目前甾体类激素已经成为除抗生素外的第二大类药物，在医疗领域发挥着重要的作用。随着人们对甾体化合物的相继研究，甾体衍生物羟基化的生物转化也受到了大家的广泛关注，甾体衍生物羟基化的生物转化使得最终产生了更多高效的中间或者终末产物，且甾体衍生物的生物转化具有诸多优点，例如转化过程中涉及的程序少，转化周期短，转化后副产物较少而有用的产物的收率较高，且具有专一化和快速精准的优点，此外还具有安全无公害，始终坚持绿色原则，该转化方法是目前生物合成甾体类相关药物的主要途径[1]。

1 生物转化

生物转化(Biotransformation)又称为生物催化，是指某类物质经过多种酶的催化作用而进行的代谢转化，而外源物是需要转化的对象，生物转化的实质是使外源化合物利用生物体系本身具有的酶而进行的酶促催化反应，目前主要的酶促反应主要有氧化还原反应、羟基化反应、脱氢脱羧、酯化酰基化等，多数酶促反应需要在温和的环境中进行，进行生物转化的重要原因之一就是为了维持机体内环境的稳态[2]。生物转化与传统的有机溶剂相比，主要具有以下几方面优点：首先是为整个催化体系提供了区别于于传统分子溶剂的反应环境，该环境能够有效改善相关酶或细胞的活性，从而进一步提高了反应速率和产率。生物转化具有高选择性、作用温和等特点，其中主要的生物催化方法包括全细胞生物催化转化法、固定化细胞催化转化法以及静态细胞生物催化转化法。依据底物来源不同又可以将转化法分为植物转化动物转化法以及微生物转化法等。

在所有的生物转化中，微生物转化是比较常见的一种，微生物转化又称为微生物酶法转化，是指微生物利用自身代谢功能而进行一系列的有机反应，微生物转化过程中所需要的酶促生物催化剂来源于微生物细胞，该过程具有快速准确，操作便捷以及区域和空间感选择性较强、成本低等优点。因为微生物转化能够合成一些自然界不具有的中间产物，或者经过化学合成法无法合成的药物，使得该方法受到广大微生物学者、有机化学学者以及药学学者的青睐。我国著名药学家屠呦呦老师从中药青蒿中提取到了青蒿素，青蒿素是一类继氯喹、乙氨嘧啶和伯喹等药物后用来治疗疟疾的比较有效的药物，同时青蒿素具有较低的毒性，青蒿素被世界卫生组织称为“世界上唯一有效的疟疾治疗药物”，为治疗疟疾作出了重大贡献。

2 甾体衍生物羟化反应

2.1 甾体衍生物羟化反应原理

甾体化合物本身属于小分子化合物且具有脂溶性大的特点，较好的脂溶性使其易于进出细胞，当甾体化合物进入细胞后，会在细胞内发生一系列的生理变化反应，由于其自身结构和功能的特点而使甾体化合物成为较好的药物分子[3]。例如在临床上，甾体化合物中的肾上腺皮质激素可以用来作为治疗支气管哮喘、类风湿性关节炎等疾病的良好药物。另外，甾体化合物中的激素还可以起到较好的生理保健功能，例如可以有效改善机体肥胖、增强体力以及改善机体蛋白质等代谢等作用。甾体化合物的原料主要来自于植物的甾醇，例如油菜的甾醇、β-谷甾醇以及豆甾醇等，而这些甾醇主要来源于豆类植物，而另一类甾体化合物主要是指存在于一些真菌体内的麦角甾醇，在黄体酮等药物的生产过程中比较常见，目前在分枝杆菌体内也发现了甾醇的分布。同位素示踪实验结果显示甾体衍生物的羟基化反应是基于甾体上的羟基直接将甾体碳架上的氢原子的位置取代，且在取代过程中未发生空间构型的改变，且羟基转化过程中的氧不仅由水中的氢氧基提供，而且空气中的氧也为其提供氧原子，也就是说当使用某些霉菌转化甾体时需要有足够的氧供给，从而保证羟基化过程对氧的需求。此外，甾体化合物进行羟基化反应时其羟基上的氢会被直接取代。

2.2 底物溶解率的影响

在对甾体化合物实施转化的过程中，由于甾体本身具有较差的溶解性，且在整个转化过程中会出现较多的副产物，另外，菌体的转化能力以及甾体底物的转化效率低等原因，已经成为目前生物转化技术的一大问题。由于原料溶解性的问题对甾体化合物的生物转化的影响较大，所以目前寻找新的甾体药物仍然是当下及未来需要重点关注的研究方向[4]。

2.3 甾体羟基酶

甾体羟基酶是一种诱导酶，主要存在于无细胞抽提液离心后得到的含有线粒体的上清液中，对该上清液进行分离和纯化可知，该上清液中还存在离心后分离出的微粒体，微粒体在通常条件下不进行羟化反应，而只有当微粒体和高碘酸钠结合后才具有羟基化酶。

3 甾体衍生物羟基化的生物转化研究现状

3.1 静息细胞生物催化转化法

静息细胞生物催化转化是通过制备出静态时的菌体悬浮液来进一步实施生物催化。首先取对数期生长的菌体，过滤并离心，收集菌体沉淀，再将菌体悬浮于合适的缓冲溶液中，最后再加入相应的底物来进行生物转化[5]。使用该方法制备的产物具有杂质少、易于分离纯化以及反应后的菌体可以重复利用等优点。相关研究员发现利用新金分枝杆菌生长状态时的细胞以及静息状态时的细胞作为转化体系，而只有静息状态下的细胞才能够使甾醇实现正常转化，且得到的产物不容易降解。

3.2 全细胞生物催化转化法

全细胞生物催化转化在甾体衍生物的工业生产中发挥着重要的价值。用来实施催化的酶通常分布在膜蛋白上，例外，在催化过程中还需要一些辅酶的参与，与传统的酶反应相比，全细胞生物催化转化具有步骤简单、成本低等优点，而且全细胞生物转化过程中不需要辅酶的参与，该项也使得转化成本大大降低。目前也已经发现了许多植物、动物以及微生物(细菌、真菌等)能够实现对甾体化合物的转化，其中真菌的应用最为广泛，被广泛用来对甾体药物进行转化，而且相关研究也报道称，真菌对甾体化合物进行转化时绝大部分进行的是甾体衍生物羟基化的生物转化过程。

3.3 固定化细胞生物催化转化法

甾体化合物具有较强的疏水性以及受到底物传质的制约，使得生物转化效率受到了影响，针对这一问题许多研究者通过研究磁场、表面活性剂以及超声波等来增强细胞膜的通透性，从而进一步增强底物的溶解。

固定化细胞生物催化转化技术在对甾体化合物进行转化时几乎已经实现了甾体药物的半连续化生产，该项技术不仅能有效增加菌体溶液的浓度，同时菌体也可以重复利用[6]。通常在对菌体进行培养时，随着培养时间的延长，菌体可能会发生自溶现象，而采取固定化细胞转化法有望解决该弊端，使得菌体保持开始的状态。固定化细胞转化法主要包括底物包埋和交联、载体介质的吸附以及共价结合等主要步骤，此外，固定化细胞应用于载体化合物羟基的生物转化中时的催化效率主要取决于载体本身的性质特点，其次反应条件的设置会对菌体细胞活性产生一定的影响。目前常用的固定化甾体有海藻酸盐凝胶、聚乙烯醇、葡聚糖凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶等，在实际操作中将收集到的菌体固定到聚丙烯酰胺凝胶中可以重复多次地催化底物发生羟基化反应，从而在最大程度上提高固定效率和产率。

4 结语

文章重点阐述了生物转化相关应用以及甾体衍生物羟基化的生物转化原理，此外进一步阐明了甾体衍生物羟基化生物转化的研究方向和进展。

随着生物技术的不断发展，最主要的是微生物技术的应用，甾体衍生物的转化已经不只是局限于转化效率和转化的专一性，而更加注重的是转化的途径和过程，安全高效的转化过程是大家迫切追求的结果，许多科学家利用分子生物学、合成生物学等多种生物方法和策略来优化甾体类药物的合成过程。甾体衍生物尤其是作为药物的甾体化合物通常均具有较高的药理活性，甾体衍生物羟基化转化能否取得较高的产率一直都是制备的难题，而如何有效地提高底物浓度，即在转化过程中拥有更多有利的产物，构建并选择有效的生物转化介质，同时解决底物疏水性等问题，对提高底物浓度，增加产率具有重要意义。因此现阶段需要寻找更加普适的转化体系，构建新型绿色的生物转化体系是目前亟待解决的问题，新型“绿色溶剂”成为大家迫切关注的问题。

综上所述，在对甾体衍生物羟基化进行生物转化时仍然需要我们依据现有的理论知识和现有的实践经验而不断去探索，去选择新的途径，依据前人的科学研究经验，总结并归纳相关转化体系和技术，对其进行深入细致的研究，虽然距产物大规模工业化尚有一定的距离，但是应用前景广阔。