深静脉血栓形成炎症信号通路研究进展①

顾燕妮 谢春毅 (上海中医药大学附属上海市中西医结合医院心内科，上海 200082)

深静脉血栓形成(deep vein thrombosis,DVT)和它主要的并发症肺栓塞(pulmonary embolism,PE)被称为静脉栓塞(venous thromboembolism,VTE)，是导致死亡和伤残的主要原因之一。VTE在心脑血管疾病发病中排列第三，仅次于心肌梗死和中风[1]。近30年，有关血栓诊断、预防性抗凝用药和溶栓治疗有很大进展，但VET的发病率和死亡率并无明显下降趋势[2]。下肢DVT通常表现为疼痛、红肿以及行走困难等。不稳定血栓往往容易脱落并阻断肺循环引起PE。以往DVT研究主要集中在抗凝系统，通过靶向凝血酶、依赖Vit K的凝血因子或者活化的凝血X因子(activated factor X,FXa)。然而，抗凝剂的使用因增加出血倾向和治疗窗狭窄导致临床很难把控。静脉血栓(vein thrombosis,VT)形成可分为血流阻断和缺氧、内皮细胞活化以及炎症细胞募集3个阶段[3]。血栓形成是极其复杂的过程，目前研究更多关注于中性粒细胞、血管内皮细胞、血小板和单核/巨噬细胞等固有免疫细胞参与的血栓形成病理发病机制，由炎症细胞释放的前炎症因子，如IL-1家族和TNF-α共同作用导致的机体慢性炎症过程，其中炎症信号传导起着重要作用。本文就炎症信号通路在DVT发生和发展中的作用机制研究进展做一综述。

1 Toll样受体(Toll′s like receptor,TLR)信号通路与DVT

败血症和内毒素血症均可引发VT。给予小鼠LPS可诱发血栓形成，外周血细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule 1,ICAM-1)水平增高，经结扎的下腔静脉(inferior vena cava,IVC)白细胞黏附和聚集增加。Tlr-4-/-基因敲除内毒素血症小鼠模型血栓形成减少，外周血ICAM-1水平降低。Icam-1-/-基因敲除内毒素血症小鼠血栓形成也减少。实验证明，LPS诱发早期VT依赖于TLR4和ICAM-1的表达，并通过中性粒细胞得以增强。抑制ICAM-1或者/和TLR4的表达可能是预防内毒素血症诱导VT的一种策略[4]。TLR4在心肌梗死和动脉粥样硬化中同样起重要作用，TLR4可以通过增加组织因子(tissue factor,TF)的表达及活性促进血栓形成，TF 的作用主要是在凝血发生时将凝血酶原转化为凝血酶。四川泸州医学院的相关研究表明，影响血栓形成的TLR4主要来源于内皮细胞，不是血小板所表达的TLR4[5]。高迁移率族蛋白B(high-mobility group box 1 protein,HMGB1)是非特异性炎症的重要介质，血小板释放HMGB1是引起微血管血栓的主要原因，它能加剧DVT发生和增强中性粒细胞胞外捕获(neutrophil extracellular traps,NETs)。在急性和亚急性以及慢性VT形成中，源自血小板和蓄积在血栓中的HMGB1均起重要作用；在血栓形成前，血小板的HMGB1通过促进中性粒细胞募集和增强NET而起作用[6]。血小板活化后其表面HMGB1暴露，致使单核细胞募集增加，HMGB1发生氧化并释放活性，促使血小板聚集。这个过程可增强HMGB1积蓄，通过促糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE)再进一步活化单核细胞的TLR2，导致局部释放单核细胞来源的TF和炎症因子[7]。

氧化应激和感染时，血小板活性增强是血栓形成前常见的病理反应。Panigrahi等[8]发现，这种现象往往伴随着TLR识别的自身配体改变。血小板表达大量TLR，包括TLR9。在氧化应激情况下，烷基吡咯蛋白加合物(alkylpyrrole protein adducts)是血栓形成时TLR9的一种新的特殊配体。体外实验显示：烷基吡咯蛋白加合物可促进血小板活化、分泌颗粒以及血小板聚集；在体内试验中，烷基吡咯蛋白加合物通过TLR9/MyD88信号通路促进血栓形成。TLR9配体诱导白介素-1受体相关激酶(interleukin-1 receptor-associated kinase 1,IRAK1)和蛋白激酶(protein kinase B,PKB，习惯称为Akt)磷酸化，这一过程依赖于酪氨酸蛋白激酶(tyrosine-protein kinase,CSK，习惯称为Src激酶)。内源性血小板激动剂与TLR9配体协同作用诱导TLR9表达于血小板表面。该研究表明，TLR9是一个血小板的功能性受体，与氧化应激、固有免疫和血栓形成密切相关。如果阻断TLR9信号通路，VT将无法形成。另有研究表明，在基因敲除小鼠(Tlr9-/-)阻断血流制造血栓模型中可以观察到，血栓形成体积与非基因敲除小鼠相比增大62%。TLR9的作用主要显现在阻断血流模型中，缺乏TLR9将增加VT坏死和凋亡以及NET。该研究提示阻断血流的血栓形成早期主要涉及PMN信号通路TLR9的作用，与血小板或NET无关。该研究在DVT发生机制上提出了一个新的观点，即早期使用免疫调节剂调理中性粒细胞对预防DVT发生有作用，并可避免抗凝剂使用过程中的出血风险[9]。Dewyer等[10]研究表明，在实验性VT血栓溶解期和静脉壁损伤中TLR9具有不同的作用。髓源性单核细胞培养中加入多种内源性损害信号，则纤溶基因表达下降。过继Tlr9+/+髓源性单核/巨噬细胞给Tlr9-/-小鼠，第8天VT消退并恢复至正常状态，但不能改变静脉壁纤维化。因此提出，单核细胞的TLR9信号是VT后期消散的关键，与清除坏死的炎症细胞有关。急性DVT动物模型显示TLR9促进血栓溶解，但临床DVT患者TLR9表达与动物实验结果并不一致。Cheung等[11]检测了PTS合并血栓形成后综合征(post-thrombotic syndrome,PTS)、血栓残留和反复DVT三组患者白细胞上表达的TLR9 mRNA，并与正常人群组对照，PTS和血栓残留组患者TLR9 mRNA表达是低的，但并没有显著统计学差异；而反复DVT患者TLR9表达显著高于DVT患者，提示TLR9可能参与反复发作DVT病理机制。

综上所述，DVT发病机制中有多种类型的TLR参与，主要涉及TLR2、TLR4和TLR9，同时这些TLR分布于不同的炎症细胞，包括：血管内皮细胞、中性粒细胞、单核/巨噬细胞和血小板等，并通过不同的炎症信号通路影响DVT形成，但各个研究观察侧重各异，大多使用LPS诱导和下腔静脉结扎形成DVT的小鼠模型。总体上，动物实验的结果提示TLR4和TLR2可促进血栓形成，而TLR9信号传导可抑制血栓形成。氧化应激和感染情况下，烷基吡咯蛋白加合物是血栓形成时TLR9一种新的特殊配体，这个配体在加剧血栓形成中的信号传导过程值得进一步深入研究。临床DVT相关TLR表达的结果与动物实验结果并不完全一致。在DVT形成的不同阶段中TLR的意义尚未明确，有待进一步深入研究。

2 炎症小体(Inflammasome)信号通路与DVT

炎症小体由caspase-1、核苷肽结合结构域和富含亮氨酸家族包含热蛋白结构域3(nucleotide binding domain,leucine-rich-containing family,pyrin domain containing 3,NLRP3)以及接头蛋白ASC(凋亡相关斑点样蛋白， apoptosis-associated speck-like protein containing) 3部分共同组成复合物[12]。炎症小体所接受的多种炎症信号可激活caspase-1，剪切前体IL-1β p31产生具有活性的IL-1β p17成分，并促进凝血机能或应答病原体刺激。血小板释放的活性IL-1β作用于巨噬细胞，巨噬细胞进一步促进血小板活化[12]。最近体外实验证明，NLRP3能促进血小板活化和聚集，并促进血栓形成。NLRP3依赖于Bruton酪氨酸激酶(Bruton′s tyrosine kinase,BTK)激活caspase-1而产生活性IL-1β。使用抑制血小板BTK表达的药物可导致血小板活性和聚集功能下降，从而减少血栓形成。血小板功能与BTK和NLRP3有关，涉及异常凝血功能与炎症发生机制[13]。低氧也是DVT的重要原因。有研究利用低氧条件制作VT动物模型，通过炎症小体复合物NLRP3的活化增加IL-1β的分泌。结果显示，低氧状态下低氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor 1-alpha,HIF-1α)增加了NLRP3表达。HIF诱导炎症小体NLRP3活化使静脉处于炎症前状态是急性血栓形成的关键[14]。细胞外 ATP是一个组织损伤的信号，它可诱导巨噬细胞产生应答并促进炎症发生和血液凝集。Rothmeier等[15]研究报道，ATP信号是通过巨噬细胞的P2X7受体解离硫氧还原蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TRXR)系统，并通过胞内生成氧自由基(reactive oxygen species,ROS)活化炎症小体。TRXR和炎症小体的活化促进了巨噬细胞丝状伪足的形成和产生促凝微粒，并降低硫氧还原蛋白。血小板炎症小体诱导胞内caspase-1/钙蛋白半胱氨酸蛋白酶活化产生级联反应降解细丝蛋白，从而切断细胞支架和TF的连接，促进TF释放，使血小板表面受体对促凝反应进行应答。这种级联效应能激活TF转运至巨噬细胞的丝状伪足并释放，成为高度促凝微粒。此外，caspase-1促进巨噬细胞表面暴露特异性肌动蛋白，有助于丝状伪足释放高度促凝微粒。这个研究完整诠释了血栓炎症小体通路，并提出了炎症小体和信号通路中各个参与成分是潜在的药理靶点，可减少炎症及固有免疫细胞诱导的血栓形成。

血小板所含炎症小体活化的关键在于caspase-1激活，并产生活性IL-1前炎症因子，启动后续巨噬细胞参与血栓形成炎症病理过程，抑制炎症小体活化环节可能成为DVT预防和治疗的潜在靶点。

3 核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路与DVT

NF-κB是控制DNA转录、细胞因子分泌和细胞存活的一种蛋白复合物。血小板表达的TLR 被病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)识别，并通过NF-κB信号传导引起免疫应答。Rivadeneyra等[16]相关研究认为，血小板激动剂(Pam3CSK4)通过NF-κB介导血小板活化，并且该激动剂被明确是TLR2和TLR4下游的信号。血小板激动剂或LPS可导致NF-κB IκBα降解和NF-κB p65磷酸化，阻断TLR2和TLR4以及凝血酶协同活化血小板。Pam3CSK4触发血小板凝集、纤维蛋白原结合和释放凝血因子vWF。LPS增强了凝血酶诱导的凝集，并结合纤维蛋白原和分泌ATP，LPS对血小板本身并无作用。该实验明确Pam3CSK4诱导P选择素和CD40配体表达形成血凝状态。除了CD40配体外，所有这些应答过程均可被NF-κB抑制剂所抑制。在炎症性和感染性疾病中，抑制NF-κB信号传导是一个潜在预防TLR2和TLR4触发血小板活化的治疗靶点。Sun等[17]发现，正常对照组大鼠过氧化物酶增殖体活化受体-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPAR-γ)/NF-κBp65均为低表达，并均存在于细胞浆内；LPS诱导的脓毒血症大鼠NF-κB p65表达显著升高，并转入核内表达，而PPAR-γ表达与对照组无显著差异；PPAR-γ激动剂罗格列酮预处理经LPS诱导的脓毒血症大鼠，PPAR-γ表达显著升高，并转入细胞核内，NF-κB p65表达显著降低，并表达于细胞浆，不转入细胞核内。LPS激发的脓毒血症大鼠凝血酶原时间(prothrombin time,PT)和部分促凝血酶原激酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)显著延长，纤维蛋白原(fibrinogen,FIB)降低，D-二聚体显著增高；罗格列酮预处理大鼠组PT和APTT时间显著缩短，FIB增加，D-二聚体显著降低。研究表明，罗格列酮可改善脓毒血症的凝血功能障碍，PPAR-γ/NF-κB信号转导在血小板活化和高凝状态炎症免疫应答机制中起着重要作用。另有研究报道[18]，内皮细胞中的非肌肉组织所包含的肌球蛋白重链ⅡA(non-muscle myosin heavy chain ⅡA,NMMHC ⅡA)参与了血栓形成和炎症微粒释放。用TNF-α激发内皮细胞诱导TF表达，使用NMMHCⅡ抑制剂预处理，可抑制TF促凝活性。NMMHCⅡ抑制剂促进了Akt 和糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)磷酸化并抑制NF-κB p65核转运，以及NF-κB IκBα降解。NMMHCⅡ抑制剂下调TF的作用可被PI3K抑制剂拮抗。采用siRNA敲低NMMHCⅡA表达，TF活性、Akt/GSK3β活化以及NF-κB信号通路也可被抑制，从而抑制小鼠DVT形成。这个研究揭示，抑制NMMHCⅡ、阻止TF表达和VT形成是通过内皮细胞的Akt/GSK3β-NF-κB信号通路实现的。NMMHCⅡA可能是新的潜在治疗DVT的靶点。细胞外组蛋白是促炎介质，也是近年来所认识的炎症激发的细胞死亡所释放的一种炎症介质，它可促进脓毒血症患者内皮细胞功能损害、凝血酶形成、脏器衰竭和死亡。临床研究显示，组蛋白-DNA复合物血浆浓度与DIC严重程度呈正相关，是脓毒血症预后不良的指标[19]。Yang等[19]研究证实，血管内皮细胞和巨噬细胞的胞外组蛋白诱导TF表达呈剂量与时效依赖关系。用特异性中和抗体封闭细胞表面TLR4和TLR2可显著降低组蛋白诱导的TF表达。内皮细胞胞内组蛋白促进NF-κB(c-Rel/p65)运转至核内，与激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)表达呈时间依赖关系。NF-κB和AP-1基因突变均可显著降低组蛋白诱导的TF表达。该研究结果证明了内皮细胞胞外组蛋白是通过细胞表面TLR4和TLR2诱导TF表达，同时也依赖转录因子NF-κB和AP-1的活化。内皮细胞的血栓调节蛋白(thrombomodulin,TM)是参与抗凝、抗炎、细胞保护和胎儿生长发育的一种重要的保护性蛋白。TNF-α通过活化NF-κB，在一定程度上可抑制TM的表达，从而加剧DVT的发生。Pathak等[20]研究了NF-κB的上游信号通路，即用TNF-α处理内皮细胞，观察TM表达时调节性丝氨酸激酶和抑制性Kappa-B激酶(inhibitory kappa-B kinase-β,IKKβ)的活性。结果发现，抑制IKKβ可增加TM表达及其功能，同时可削弱TNF-α介导的TM下调作用。与此相反，抑制NF-κB 家族成员p50和p65(RelA)下游并不能上调TM表达。敲低经典和非经典NF-κB通路家族成员cRel和RelB导致 TM过表达，IKKβ被抑制，并增强了Krüppel样因子2(Krüppel-like factor 2,Klf2)与TM启动子的结合，TM启动子活性提高。敲低Klf2可完全消除IKKβ抑制介导的TM上调作用，说明NF-κB上游信号IKKβ调节TM表达的关键在于Klf2[20]。

NF-κB信号通路介导了TF表达，也参与了内皮细胞和血小板活化、聚集等过程，与DVT形成有关，NF-κB信号通路相关的酶及炎症介质可以成为靶向治疗VTE的方法。如目前已用于临床的罗格列酮对脓毒血症的治疗，它通过提高PPAR-γ表达，减少DIC的发生；以及类似TNF-α单克隆抗体等用于临床DVT将大大拓展和改变仅用抗凝剂治疗的局面，但NF-κB信号通路与DVT药物治疗的适应症及预后判断仍有待进一步明确。

4 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路与DVT

非对称性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine,ADMA)是一种有效的内源性NO合酶抑制剂，它与血管内皮细胞功能障碍密切相关，ADMA合成增加或分解代谢减少均影响DVT形成和发生。Zhang等[21]研究发现，ADMA通过抑制血管纤溶活性可加快血栓形成，抑制NO产生并活化它下游的p38 MAPK和NF-κB通路。缓激肽对血管损伤有多重保护作用，能减少多种因素引起的凝血级联反应，而决定血栓形成的重要因素之一是TF。有研究采用LPS诱导人脐静脉内皮细胞和单核细胞表达TF，给予外源性缓激肽能显著抑制TF mRNA和蛋白水平的表达，并呈剂量依赖关系。NO合成酶和磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositide 3-kinases,PI3K)抑制剂均能阻断缓激肽对TF的抑制作用，缓激肽通过激活PI3K/Akt信号通路抑制GSK-3β和MAPK的活性，并降低核内NF-κB水平，从而抑制TF的表达。小鼠腹腔注射缓激肽也能抑制结扎下腔静脉形成的血栓[22]。芍药苷是中药芍药的主要成分，研究认为芍药苷具有预防血栓形成的作用。尿激酶是一种纤溶活化剂丝氨酸蛋白酶，该酶能显著溶解血栓。Ye等[23]发现芍药苷能显著上调动物血栓模型前列腺素F1a、纤维连接蛋白和尿激酶，均可抑制FIB、D二聚体和血栓素B2。芍药苷通过增加MAPK14(p38)和MAPK 8(JNK)磷酸化信号通路增加尿激酶表达，从而改善高凝状态和血栓再通，因此芍药苷具有预防和治疗血栓的作用。磷酸肌醇依赖的蛋白激酶1(phosphoinositide-dependent protein kinase 1,PDK1)能通过GSK3β调节血小板AP-4活化和血栓形成。Manne等[24]近期研究发现，阻止血栓素生成可降低2-甲巯基ADP(2-methylthio-ADP,2MeSADP)磷酸化，并抑制PDK1诱导人和小鼠血小板凝集，在(pdk1-/-)基因敲除的小鼠中也可得到同样的结果。PDK1也是丝裂原活化蛋白激酶的激酶1/2(mitogen-activated protein kinase kinase 1/2,MEK1/2)、胞外信号调节激酶1/2和细胞溶质磷脂酶A2等磷酸化所必需的，它们指导了PDK1调节MAPK上游激酶通路。Raf-1属丝氨酸/苏氨酸激酶，是MAPK通路上游的激酶，药物抑制和PDK1基因缺失均能有效预防Raf-1磷酸化。体内实验证明，敲除小鼠PDK1基因或药物抑制PDK1均能有效防止胶原/肾上腺素诱发的肺栓塞。血小板的PDK1对血栓素生成和血栓形成起主要抑制作用，并通过2MeSADP 调节MAPK通路的活化。Koch等[25]研究LPS诱导触发的高凝状态中， MAPK p38抑制剂可强烈抑制凝血活性，而JNK和NF-κB的抑制剂没有明显作用，与其他研究结果所认为的细胞内信号通路MAPK p38、JNK和NF-κB均具有决定性作用结论不一。

大部分研究表明p38 MAPK、JNK和NF-κB信号通路对DVT的炎症病理过程有关键作用，阻断p38 MAPK、JNK和NF-κB信号通路对DVT具有潜在治疗作用，但对JNK和NF-κB尚有争议。

5 其他参与DVT形成的炎症信号通路

DVT形成和动脉粥样硬化的高危因素是炎症导致的血小板过度活化。胶原刺激血小板可激活信号转导及转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription,STAT3)，STAT3催化脾脏酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk)和磷酸肌醇磷脂酶Cγ2(phosphoinositide phospholipase Cγ2,PLCγ2)与基质互相作用，进一步促进胶原诱导的钙动员和血小板活化。血小板释放的前炎症因子IL-6也可促进胶原诱导的STAT3活化。有研究表明，血小板的STAT3非转录活化有利于前炎症因子释放和血栓形成，并与凝血因子之间产生信号互动。这种信号互动是炎症导致血小板过度活化的原因[26]。

血小板过度活化是衰老导致DVT发病率和死亡率显著增加的重要原因之一。相关研究表明，与老化相关的血小板过度活化和DVT发病机制的靶点在于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin complex1,mTORC1)信号通路。衰老小鼠血小板和巨核细胞的mTORC1是超活化的，并伴随着平均血小板体积(mean platelet volume,MPV)增加以及血小板活化。用雷帕霉素抑制mTORC1信号通路可显著降低DVT易感性。说明血小板mTORC1活化在DVT中有着特殊作用。敲除血小板和巨噬细胞中mTORC1基因的特殊成分Raptor，血栓显著缩小，同时血栓形成程度变轻。增加ROS诱导衰老小鼠血小板和巨噬细胞中mTORC1活化，可促使骨髓中巨核细胞变大、MPV增加和血小板活化，并加剧老化相关的DVT发生。清除氧自由基可改善这种状况。研究结果证明，mTORC1增加DVT易感性是通过增加MPV和血小板活化实现的[27]。

最后需要指出的是，现有报道的急性DVT实验大部分采用LPS诱导的小鼠模型，与临床实际发生的DVT可能存在机制上的不同，更多老年人群发生的DVT可能更多涉及慢性炎症机制，尚有待进一步深入研究。

6 小结

综上所述，TLR、NF-κB、炎症小体、MAPK、JNK和STAT3等炎症信号通路在DVT形成的病理过程中均有重要作用。大部分炎症信号通路通过增加TF的表达、内皮细胞和血小板活化以及聚集，加剧了血栓形成和发展。目前临床对DVT的治疗大部分尚停留在抗凝治疗，这也造成了近30年来该症的发病率和死亡率均无下降趋势的原因。随着DVT炎症发病机制研究的不断深入，揭示了DVT的防治更应注重免疫调节和针对炎症反应环节的靶向治疗。对DVT的干预策略笔者更倾向于中医和中西医结合综合治疗，或更多发掘和研究中医药治疗DVT在炎症信号通路方面的作用机制，如：红景天苷可显著抑制ERK、JNK和p38 MAPK蛋白[28]；雷公藤多甙可提高血管平滑肌α-肌动蛋白[29]；五味子甲素可抑制NLRP3活化诱导的caspase-1活性[30]等。总之，在DVT病程进展中，血栓形成与全身和局部炎症状态相关，DVT本质上是一种免疫炎症性血栓，与目前单纯抗凝、溶栓以及血管外科手术治疗在理念上存在很大差异。通过炎症信号通路研究提供更安全更有效的DVT抗炎治疗和预防措施会有更好的前景。