侵染海南雪茄烟的中国黄花稔曲叶病毒侵染性克隆的构建

李萌，夏长剑，杨金广，王天玉，吕洪坤，吴会杰

1 郑州轻工业大学烟草科学与工程学院，河南郑州高新区科学大道136号 450000；

2 中国烟草总公司海南省公司海口雪茄研究所，海南省海口市红城湖路22号 571100；

3 中国农业科学院烟草研究所，山东青岛崂山区科苑经四路11号 266101；

4 中国农业科学院郑州果树研究所，河南郑州未来路最南端 450009

中国黄花稔曲叶病毒（Sida yellow mosaic China virus，SiYMCNV）于2005年在海南儋州表现黄化、花叶症状的杂草黄花稔（Sida acuta）上分离并命名[1]。SiYMCNV属双生病毒科（Geminiviridae）金黄色花叶病毒属（Begomovirus），其病毒基因组由DNA-A和伴随的卫星DNA-β构成[1]。除黄花稔外，该病毒还可侵染杂草胜红蓟 （Ageratum conyzoides）[2]。由于SiYMCNV仅侵染杂草，自2006年以后，未发现该病毒的研究报道。

2018年4月课题组在海南儋州雪茄烟栽培基地发现一些烟株呈现矮化、曲叶、脉突等典型的曲叶病毒病症状（图1），病叶样品中扩增得到的DNA-A和DNA-β全长与Xiong等[1]2005年报道的SiYMCNV的DNA-A和DNA-β的序列相似度分别为99%和93%，表明烟草也是SiYMCNV的自然寄主[3]。SiYMCNV曲叶病毒病在海南儋州雪茄烟上的发病率约为1%～5%，发病植株完全丧失经济价值，造成绝收。因此，本文以侵染海南雪茄烟的SiYMCNV分离物为材料构建了SiYMCNV可高效侵染烟草的侵染性克隆，为分析该病毒对烟草的致病性及进一步开展病原-媒介生物互作、烟草抗病性鉴定等研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料

PCR 仪（美国 Thermo Fisher Scientific 公司）；MiniBIS Pro凝胶成像系统（以色列DNR公司）；DYY-6C电泳仪（北京六一生物科技有限公司）。磁珠法植物基因组DNA提取试剂盒（洛阳吉恩特生物科技有限公司）；植物表达载体pCAMBIA1300（中国农业科学院郑州果树研究所瓜类病害课题组保存）；GV3101农杆菌（中国农业科学院郑州果树研究所瓜类病害课题组保存）；高保真PCR酶（南京诺唯赞生物科技有限公司）；引物（上海生工生物工程有限公司）。

病叶于2018年4月采自海南儋州海口雪茄研究所试验田，染病植株显著矮化、叶片扭曲，脉突明显（图1）；接种烟草品种为雪茄烟H382。

1.2 实验方法和条件

1.2.1 DNA提取

称取20 mg病叶样品放入1.5 mL离心管中，应用玻璃研磨棒在离心管内将病叶研磨成均匀浆液，按照DNA提取试剂盒说明书提取病毒基因组DNA。

1.2.2 SiYMCNV DNA-A侵染性克隆构建

以感染病毒的雪茄烟总基因组DNA为模板，应用引物 A-0.5-PstI-F 和 A-XbaI-R（表1）扩增 0.5倍的DNA-A全长序列，回收的扩增产物与经Pst1和XbaI酶切的载体pCAMBIA1300用infusion酶连接，通过双酶切和测序筛选pCAMBIA1300-0.5A阳性克隆；以感染病毒的雪茄烟总基因组DNA为模板，应用引物A1-XbaI-F和A-XbaI-R（表1）扩增 DNA-A全长，回收的扩增产物与经XbaI酶切的pCAMBIA1300-0.5A载体用infusion酶连接，获得含有1.5倍串联重复DNA-A侵染性克隆pCAMBIA1300-1.5A。

图1 海南田间感染中国黄花稔曲叶病毒植株症状Fig.1 Tobacco plant infected by Sida yellow mosaic China virus in the field in Hainan province

表1 构建侵染性克隆和接种植物DNA-A和DNA-β检测所用引物Tab.1 Primers for construction of infectious clones and for detection of DNA-A and DNA-β in agro-inoculated host plants

1.2.3 SiYMCNV DNA-β 侵染性克隆构建

以感染病毒的雪茄烟总基因组DNA为模板，应用引物β-PstI-F和β-BamH I-R扩增DNA-β 全长序列，回收的扩增产物与经Pst I和BamH I酶切的载体pCAMBIA1300用infusion酶连接，通过双酶切和测序筛选pCAMBIA1300-β阳性克隆；以感染病毒的雪茄烟总基因组DNA为模板，应用引物 β-BamH I-F和β-BamH I-R（表1）扩增DNA-β全长，回收扩增产物与经BamH I酶切的pCAMBIA1300-β载体用infusion酶连接，获得含有2倍串联重复DNA-β全长侵染性克隆pCAMBIA1300-2β。

1.2.4 转化农杆菌

采用液氮冻融法分别将经双酶切和测序筛选测序确认的pCAMBIA1300-1.5A和pCAMBIA1300-2β转化农杆菌GV3101，筛选阳性克隆获得携带1.5倍串联重复DNA-A的农杆菌GV3101-A和2倍串联重复DNA-β 全长的农杆菌 GV3101-β。

1.2.5 农杆菌侵染烟草

分别将 GV3101-A 和 GV3101-β 接种于 50 mL LB液体培养基在28℃培养24 h，4000 rpm离心后将菌液在 50 mL 悬浮液（10 mM MgCl2，10 mM 2-（N-吗啡啉）乙磺酸，200 μM乙酰丁香酮）中重悬浮。将重悬浮后的GV3101-A和 GV3101-β以1：1比例混和，用1 mL无菌注射器将该混合菌液注射本氏烟和雪茄烟幼苗叶片（各10株）。以接种含空载体pCAMBIA1300农杆菌的本氏烟和雪茄烟作为对照，单独接种GV3101-A本氏烟和雪茄烟幼苗各5株。接种烟苗在28℃、光周期14 h:10 h、相对湿度65%人工气候箱生长2周后观察植物发病情况。应用PCR检测农杆菌接种植株DNA-A和DNA-β（表1）。

2 结果

2.1 SiYMCNV DNA-A侵染性克隆构建

重组质粒pCAMBIA1300-1.5A经PstI酶和XbaI酶切后形成3个片段，大小分别与质粒pCAMBIA1300、1 倍 DNA-A（2751 bp）和0.5倍DNA-A（1471 bp）一致（图2）。测序结果与SiYMCNV DNA-A 一致。

图2 Pst I和 Xba I酶切重组质粒 pCAMBIA1300-1.5AFig.2 pCAMBIA1300-1.5A digested by Pst I and Xba I

2.2 SiYMCNV DNA-β侵染性克隆构建

重组质粒pCAMBIA1300-2β 经PstI酶和BamH I酶切后形成2个片段，大小分别与质粒pCAMBIA1300和1倍DNA-β（1352 bp）一致（图3）。测序结果与SiYMCNV DNA-β一致。

图3 Pst I和 BamH I酶切重组质粒 pCAMBIA1300-2βFig.3 pCAMBIA1300-1.5A digested by Pst I and BamH I

2.3 农杆菌侵染烟草

图4 SiYMCNV DNA-A或DNA-A和DNA-β混合侵染本氏烟（A）和雪茄烟（B）症状Fig.4 Symptoms induced by SiYMCNV DNA-A or by co-infection of DNA-A and DNA-β in Nicotiana benthamiana（A）and N.tabacum cv.H382（B）two weeks after agro-inoculation

注射GV3101-A和GV3101-β混合菌液的本氏烟心叶严重畸形，叶片向下卷曲（图4），发病率为100%。注射GV3101-A 的植株与对照植株叶片形态正常，未显示症状。与本氏烟试验结果类似，仅接种GV3101-A的雪茄烟植株叶片形态与对照差异不明显，GV3101-A和GV3101-β混合接种雪茄烟植株心叶严重畸形、叶片向下卷曲，发病率为100%。结果表明SiYMCNV DNA-A侵染性克隆不能导致本氏烟和雪茄烟产生症状，而DNA-A和DNA-β混合侵染可导致本氏烟和雪茄烟产生与田间自然侵染植株类似的曲叶症状。GV3101-A接种烟草均可检测到DNA-A特异性片段（728 bp），GV3101-A和GV3101-β混合接种烟草均可检测到DNA-β特异性片段（808 bp）（图5）。

图5 SiYMCNV DNA-A或DNA-A和DNA-β混合侵染本氏烟（A）和雪茄烟（B）PCR检测验证Fig.5 Confirmation of DNA-A infection or co-infection of DNA-A and DNA-β in agro-inoculated Nicotiana benthamiana（A）and N.tabacum cv.H382（B）by PCR

3 讨论

与烟草曲叶病毒病重要病原中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)）类似，SiYMCNV DNA-A 单独侵染不能导致寄主植物表现症状，必须和DNA-β共同侵染才能导致烟草表现症状，DNA-β编码的致病因子βC1蛋白与寄主植物相关基因的互作可能是发病植株叶片畸形的重要机制[4]。

烟粉虱传播的曲叶病毒病是我国福建、云南、广西等南方烟区重要的烟草病害[5-7]，海南由于以往烟草栽培面积较少，双生病毒病主要报道在黄花稔[1]、胜红蓟[2]等杂草及甜瓜[8]上发生危害。海南是我国为数不多的适宜雪茄烟栽培的地区之一，其充沛的水热条件为双生病毒病及其媒介昆虫烟粉虱的发生提供了适宜的生存及发生扩散条件，随着海南雪茄烟种植面积的增加，曲叶病毒病将成为威胁海南雪茄烟产业发展的重要病害。本研究成功构建了侵染海南雪茄烟的中国黄花稔曲叶病毒DNA-A及其伴随的DNA-β侵染性克隆，DNA-A和DNA-β侵染性克隆可通过农杆菌叶片注射高效侵染本氏烟和栽培雪茄烟H382。DNA-A和DNA-β复合侵染烟草表现典型的曲叶症状，这进一步证实了中国黄花稔曲叶病毒是海南儋州雪茄烟曲叶病毒病的病原。SiYMCNV侵染性克隆的构建为进一步开展病毒致病机理和病原-媒介昆虫-寄主互作等研究奠定了坚实基础，也为快速筛选、鉴定抗SiYMCNV烟草种质资源提供了简单、高效的技术手段。