凯旋柑小种子三倍体选育初报

王 平 罗君琴 聂振朋 柯甫志 徐建国

（浙江省柑橘研究所/国家品种改良分中心 台州318026）

三倍体材料因其果实无籽、抗性强等优点而倍受育种工作者的青睐。柑橘三倍体小种子是由于二倍体母本在杂交过程中产生不完全减数的配子而形成，其在柑橘二倍体杂交后代中普遍存在，是选育柑橘可遗传三倍体材料的一个重要途径[1～3]。但小种子胚弱，自然播种萌发率极低，需要通过组培技术提高植株再生率[4]。本研究以多籽凯旋柑品种为材料，利用流式细胞术快速筛选出三倍体组培苗，为进一步改良多籽柑橘品种、丰富柑橘三倍体种质资源奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

自然授粉的凯旋柑成熟果实晴天采摘于浙江省柑橘研究所山站试验园，剔除病虫害果、畸形果后室温放置。随机挑选50个果实进行小种子重量和出现频率统计。

1.2 小种子组培成苗技术体系

在无菌环境下，凯旋柑整果用消毒刀绕横径切1圈，扭成两半，用灭过菌的镊子挑出小种子，75%乙醇溶液灭菌处理10 min，再用无菌水清洗一次，去除种皮后分类选出中粒小种子种胚、小粒小种子种胚、中粒瘪籽种胚和小粒瘪籽种胚，接种于含0.5mg/L KT+0.5mg/L IBA 激素组合的培养基，在温度24±2℃、光强2000Lux、光照时间12h/d的模拟光照条件下培养成苗。

1.3 倍性鉴定

组培苗倍性鉴定采用流式细胞术法，检测仪器采用CyFlow®Space PARTEC 流式细胞仪，检测试剂采用CyStain UV Precise T（Sysmex Partec公司）试剂盒。

剪取组培苗嫩叶置于培养皿中，先加0.4ml 提取液置于叶片表面，用刀片切碎叶片并静置培养30s，过滤出液体，再加1.6 ml DNA染色液待测用。

2 结果与分析

2.1 不同类型种子出现频率分析

对随机选取的50 个果实种子进行统计分析，结果（表1）显示自然授粉的凯旋柑平均每果种子多达10颗以上，小种子重量均在正常种子的1/3 以下，平均每个果实中出现0.84 颗小种子。为区分小种子大小与倍性的相关性，进一步将小种子分为中粒和小粒两类进行研究，其中小粒种子均重在正常种子的1/6 以下。由于三倍体种胚弱小，极易发育不良，试验同时对瘪籽进行组培成苗并倍性鉴定，且根据种胚大小分为中粒瘪籽和小粒瘪籽两类。不同种子类型如图1所示。

图1. 自然授粉凯旋柑果实的不同类型种子

表1 不同类型种子的出现频率、重量和比值

2.2 小种子/瘪籽种胚组培成苗及其三倍体概率统计

对2017年份凯旋柑小种子//瘪籽种胚成苗植株进行倍性鉴定并统计三倍体出现概率（如表2）。2017年份通过组培技术途径共获得467 棵小种子组培苗和89 棵瘪籽组培苗，利用流式细胞术分别检测筛选出276 株小种子三倍体组培苗和13 株瘪籽三倍体组培苗，三倍体总概率达到52..3%。对不同类型的小种子//瘪籽的倍性进行了分类统计，发现中粒小种子和小粒小种子里三倍体概率极为相似，均接近60%%；而瘪籽三倍体出现概率较低，平均概率为23..4%，其中中粒瘪籽的三倍体概率最低（不足10%%）。按小种子三倍体概率计算，自然授粉的凯旋柑三倍体小种子可达0.48颗/果。

3 小结与讨论

本研究中，凯旋柑为单胚品种，其小种子的重量均在正常种子的1/3 以下，甚至小到1/6，这 与 陈 力 耕 和 胡 运 权[1]、Esen 和Soost[5]的研究结果一致。Aleza 等[4]发现三倍体小种子的产生频率与母本的遗传型密切相关，其中Fortune 为母本的杂交后代小种子三倍体概率极高，每果能培养出2.54株三倍体再生植株，而其它5 个为母本的概率在0.12～0.32 株/果。本试验中，自然授粉的凯旋柑品种每个果实可培养出0.48 株三倍体再生植株，产生概率处于中高水平。本研究结果再次验证了基于组培技术的三倍体小种子培育是选育无核柑橘材料的一个有效途径。

表2 凯旋柑小种子/瘪籽组培苗倍性概率统计