高尿酸血症及其相关疾病中miRNAs作用研究进展

马冬艳 孙凯琳 高伟微 王毅鹏

(昆明医科大学附属延安医院内分泌科，云南 昆明 650051)

高尿酸血症(HUA)是指正常嘌呤饮食状态下，非同日2次空腹血尿酸水平：男大于420 μmol/L，女大于360 μmol/L〔1〕。随着人们饮食的结构变化，HUA发病率不断升高〔2〕。Qiu等〔3〕研究表明在中国北部和东北部的健康成年人中HUA患病率高达13.7%。HUA是因体内尿酸生成增多和(或)尿酸排泄减少所致。其中尿酸生成增多约占原发性HUA病因的10%，主要由嘌呤代谢酶的缺陷引起，包括磷酸核糖焦磷酸(PRPP)合成酶活性增高、磷酸核糖焦磷酸酰基转移酶(PRPPAT)的活性或者浓度增高、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)的一部分缺失、黄嘌呤氧化酶(XO)的活性增强〔4～6〕；尿酸排泄减少约占原发性HUA病因的90%，包括肾小球滤过减少、肾小管重吸收增多、肾小管分泌减少及尿酸盐结晶沉积〔7〕。HUA可能在很长一段时间内不会引起明显的临床症状，仅有波动性或持续性血尿酸升高，但尿酸盐沉积可能已经损害了组织和内脏，实验证明，HUA不仅仅会导致痛风，而且还是心血管疾病(CVD)和慢性肾脏疾病(CKD)的独立危险因素〔8，9〕。

miRNA(microRNA)是一种内源性非编码RNA，被鉴定为基因表达转录后的调节因子〔10〕。miRNA大概是19～22个核苷酸的单链RNA，靶信使RNA稳定性通过miRNA选择性地结合到特定位点来调节〔11〕。到目前为止，已鉴定出5 000多个miRNAs，其中miRNAs在多种人类疾病中发挥重要作用，包括癌症、代谢性疾病和炎症性疾病。miRNAs主要与目标mRNAs的3′-非翻译区(3′UTR)结合，导致mRNA降解或mRNA翻译的抑制〔10〕。研究表明miRNAs可以与目标mRNAs的其他区域结合，从而导致翻译抑制或激活〔10〕。大约60%的蛋白质编码基因是被miRNAs在单个或多个细胞通路上调节的。miRNAs在人体体液中以稳定的形式存在，如血浆、唾液和尿液，所以可能是相关疾病的生物标志物〔12〕。

1 HUA发病过程中miRNAs的作用

嘌呤的生成与转化主要在肝脏中进行，终产物是尿酸，尿酸经肾小球的滤过、肾小管的重吸收、分泌及再吸收等过程，最终通过尿液排出。对于人类，近端小管重吸收在调节尿酸排泄中起关键作用〔13〕。影响嘌呤代谢和尿酸排泄过程的任何因素，都有可能导致HUA。

1.1miR-448上调通过抑制XO蛋白的表达降低尿酸的生成 XO是嘌呤核苷酸的一种分解代谢酶，可以催化鸟嘌呤、次黄嘌呤氧化为黄嘌呤，并能继续催化黄嘌呤转化为尿酸，是体内尿酸生成的关键作用酶。以黄嘌呤氧化酶为作用靶点的黄嘌呤氧化酶抑制剂，通过抑制黄嘌呤氧化酶的作用减少尿酸生成，从而有效降低血尿酸水平。别嘌呤醇是一种嘌呤类似物，结构与次黄嘌呤结构相似，只是分子N7与C8的位置发生了互换，故可抑制XO，从而抑制尿酸的生成，是血清尿酸盐异常升高的最常见的临床治疗方法〔14〕。Knake等〔15〕在临床研究中发现别嘌呤醇和呋塞米(速尿)一起用药时别嘌呤醇降尿酸作用减弱，需要加大别嘌呤醇的用药剂量才能将尿酸降至目标值，推测速尿可能通过直接与XO作用或阻碍了别嘌呤醇与XO的结合从而影响了别嘌呤醇的降尿酸作用。首先采用荧光素酶法检测XO的活性发现别嘌呤醇显示了一种剂量依赖性的XO活性抑制作用，相反，速尿(高达1 200 μmol/L)对XO活性没有影响，也不改变别嘌呤醇介导的XO抑制作用，此结果排除了速尿直接与XO作用影响嘌呤代谢的推测。其次通过人肝脏细胞(HepG2)的培养，并用别嘌呤醇和速尿进行干预时发现，别嘌呤醇干预HepG2时XO蛋白表达有明显下调，而速尿单独或速尿和别嘌呤醇一起干预时XO蛋白表达没有变化，故首次提出别嘌呤醇降尿酸作用，除了已知的直接抑制XO活性的作用，也可能由于抑制XO蛋白的表达而起作用〔14〕。为了进一步探讨别嘌呤醇和速尿对XO蛋白表达的调节作用，最后使用数据库预测软件来鉴定调控的miRNAs时发现在XO基因3′UTR上有一个miR-448结合位点，并通过验证得出别嘌呤醇或速尿干预HepG2时，HepG2 miR-448表达显著上调，而这两种药物的联合干预时miR-448的表达没有显著变化，故推测miR-448可能通过药物依赖的方式调节XO蛋白表达从而影响尿酸生成，其机制为miR-448上调抑制黄嘌呤氧化酶蛋白的表达导致嘌呤代谢受抑制从而降低尿酸的生成。

1.2miR-34a上调通过抑制尿酸盐阴离子转运体(URAT)1的表达减少尿酸的重吸收从而增加尿酸的排泄 尿酸无法自行通过细胞膜，肾脏对尿酸盐的清除是依靠专门的有机阴离子转运体(OATs)进行的。URAT1由SCL22A12基因编码，是一种电中性的尿酸盐交换子，不受细胞内外pH值和膜电位的影响完成转运尿酸，其功能是负责尿酸重吸收〔16〕。Hosoyamada等〔17〕发现进行URAT1基因敲除的小鼠血尿酸的水平比正常小鼠显著提高，提示了URAT1是尿酸的主要转运体。Enomoto等〔18〕证实尿酸盐主要是通过URAT1与有机阴离子转换的，故URAT1是非常重要的尿酸盐转运体。若URAT1蛋白的表达减少，则减少尿酸的重吸收、增加尿酸的排泄。因此，降低URAT1表达的药物可以抑制尿酸的重吸收，促进尿酸的排泄，降低血尿酸。Sun等〔19，20〕研究出中药“泄浊除痹方(XZCBD)”，可有效降低血尿酸，并采用miRNA表达谱分析方法筛选了使用XZCBD药物的HUA患者的相关miRNA发现，miR-34a存在显著差异，且miR-34a的靶位点位于SLC22A12基因3′UTR的331～338位，即URAT1基因3′UTR的271～277位，其上调抑制了URAT1的表达，从而增加了尿酸的排泄。高、中、低剂量的XZCBD均能降低HUA小鼠模型的尿酸水平，各组肾组织中普遍存在URAT1和miR-34a的表达，但随着治疗剂量的增加，URAT1的mRNA表达呈下降趋势，而miR-34a的表达呈增加趋势，尿酸水平也随之降低。因此，miR-34a可能通过药物剂量依赖的方式调节URAT1的表达从而影响尿酸排泄〔20〕，其机制为miR-34a上调抑制URAT1的表达导致尿酸的重吸收减少从而增加尿酸的排泄。

2 HUA相关心血管疾病和肾脏疾病发病过程中miRNAs的作用

2.1miRNA可能通过影响内皮细胞功能使HUA成为心血管疾病的危险因素 尿酸升高导致的各种各样的病理生理改变并不完全依赖尿酸结晶盐的沉积，尿酸本身引起的内皮损伤改变也不容小觑。血管内皮细胞具有一系列复杂的生理功能，如调节血管收缩、舒张和维持血液流变学的稳定，是循环系统发挥正常的生理功能的重要保证，而内皮细胞损伤则是导致多种心血管疾病发病的始动或促进因素。

2.1.1miR-155上调通过抑制内皮型一氧化氮(NO)合酶(eNOS)的表达、降低NO的释放在高尿酸导致内皮细胞舒张功能障碍的过程中起到了一定的作用 NO是内皮细胞中的eNOS催化L-精氨酸而生成的，是已知的最强的扩张血管因子之一〔21〕。内源性NO的产生依赖于eNOS的活性和表达，eNOS表达减少，NO也生成减少，从而影响内皮细胞的舒张。Zhang等〔22〕使用尿酸培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)后比对分析发现尿酸培养组eNOS蛋白的表达下调、细胞上清液中NO含量也下降，且具有统计学意义。然后通过分析工具预测发现人eNOS mRNA的3′UTR存在miR-155的结合序列。为了进行验证，同时采用双荧光素酶的报告系统，又证实了之前预测的结果：miR-155 能够直接靶向调控eNOS的表达。同时在高尿酸环境培养的HUVEC中，miR-155的表达出现了上升的现象，提示miR-155有可能通过调控eNOS的表达下降导致NO释放减少在高尿酸导致内皮舒张功能障碍的过程中起到了一定的作用。

2.1.2miR-663上调通过抑制转化生长因子(TGF)-β1的表达、降低磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)的表达在高尿酸导致内皮细胞迁移功能障碍的过程中起到了一定的作用 于善栋等〔23〕报道在高尿酸条件下HUVEC中表达差异最显著的miRNA是miR-663，高尿酸通过上调miR-663调控TGF-β1的表达从而抑制内皮细胞迁移。HUA患者血清中的miR-663水平也显著高于正常人，表明这种现象也可能发生在高尿酸患者中。Wang等〔24〕已证明TGF-β1通过抑制PTEN促进内皮细胞迁移，PTEN是一种多功能磷酸酶，其主要底物为磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸脂第二信使分子，磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸激活许多下游分子影响迁移〔25〕。Hong等〔26〕证实当TGF-β1过表达时，PTEN的表达降低，促进了内皮细胞的迁移；当PTEN被敲除时，内皮细胞的迁移抑制减弱，然而在高尿酸条件下TGF-β1过表达不能促进内皮细胞的迁移，故提出了一种新的抑制内皮细胞迁移的机制，即miR-663上调通过抑制TGF-β1的表达上调PTEN的表达从而抑制内皮细胞的迁移。

2.1.3miR-92a下调通过促进Kruppel样因子(KLF)2表达、抑制血管内皮生长因子(VEGF)A表达在高尿酸导致内皮细胞生成血管障碍的过程中起到了一定的作用 血管生成是内皮细胞的一种重要功能。Yu等〔27〕通过HUVEC在高尿酸的环境下和正常环境中培养对比发现高尿酸可抑制血管的形成，如血管长度和数目的减少。同时用微阵列技术对高尿酸刺激的内皮细胞进行miRNA表达谱分析发现miR-92a在高尿酸环境下内皮细胞中表达明显下调，miR-92a的下调伴随着血管生成的抑制，表明miR-92a在高尿酸环境下可能是血管生成的正调节因子。Bhattacharya等〔28〕已证明KLF2具有抑制血管生成的作用，位于KLF2下游编码的VEGFA基因是一种强促血管生成因子，因此推测KLF2可能通过下调VEGFA而抑制血管生成。然后又进一步进行miR-92a过表达实验发现内皮细胞的KLF2表达降低、VEGFA的表达增加。KLF2基因敲除、VEGFA过度表达等实验均发现可减轻高尿酸介导的血管生成抑制作用。此外，在检测HUA患者和正常人血清VEGFA水平时发现HUA患者血清VEGFA水平明显低于正常人。因此得出结论高尿酸负性调节miR-92a，增加KLF2的表达，抑制VEGFA，导致血管生成减少。内皮细胞舒张功能障碍、迁移功能障碍、新生血管功能障碍均可导致心血管疾病的发生，故miRNA可能参与了HUA相关心血管疾病的发病，使HUA成为了心血管疾病的独立危险因素。

2.2miRNA可能通过影响纤维化因子使HUA成为肾脏疾病的危险因素

2.2.1miR-519d-3p上调可能通过TGF-β信号通路调节了高尿酸肾病的发生发展 董利平〔29〕采用miRNA基因芯片技术检测发现有显著差异表达的miRNAs共11个，分别为miR-30c-2-3p，miR-1284，miR-519d-3p，miR-4682，miR-5004-3p，这5个为上调；miR-5002-3p，miR-487b-3p，miR-374a-5p，miR-30c-5p，miR-589-5p，miR-106b-3p，这6个为下调。又使用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)在HUA样本及正常对照样本中进行验证显著上调的miR-519d-3p及显著下调的miR-30c-5p、miR-374a-5p，验证结果与芯片法保持一致。进一步进行靶基因预测发现差异表达的miRNA靶基因富集在细胞增殖、信号传导、转录调控等生物学基本功能上，其中表达上调的miRNA中miR-519d-3p预测出的靶基因Smad6、骨形成蛋白和激活素的跨膜抑制剂(BAMBI)及基质金属蛋白酶(MMP)2均参与了TGF-β信号通路。TGF-β1通过TGF-β1/Smads 信号通路介导的上皮细胞向间质细胞转化最终导致肾纤维化的机制已被公认〔30〕，尿酸性肾病的肾脏病理改变以肾间质纤维化和肾小球硬化为表现，以肾间质纤维化病变为主，因此推测miR-519d-3p可能通过TGF-β信号通路调节了高尿酸肾病的发生发展。

综上，miRNA与尿酸的生成、排泄及高尿酸引起心血管、肾脏疾病可能存在密切的关系，但目前此内容在人体实验、动物实验、细胞实验、分子实验等方面均研究较少，其研究前景广阔。HUA引起心血管疾病、肾脏疾病的具体作用机制尚不明确，随着科学的发展、HUA中的miRNAs作用的深入研究，能更好地阐明miRNA在HUA中的作用，为HUA的诊治提供新的思路，也为HUA引起的心血管疾病和肾脏疾病提供新的治疗靶点。