肿瘤坏死因子与癌症相关研究进展

高世勇，李 丹

(哈尔滨商业大学药物工程技术研究中心，黑龙江 哈尔滨 150000)

肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)是1975年英格兰科学家Carswell等在被细菌内毒素感染或接种过卡介苗的小鼠血清中发现的一种物质，这种物质在体外也可以对多种肿瘤细胞产生毒性作用，能使肿瘤发生出血性坏死的同时又对正常细胞不产生伤害，故将之命名为肿瘤坏死因子。随着学者们近年来对TNF及其相关信号通路的深入了解，发现TNF是许多癌症治疗的有效靶点，TNF在医学研究中的地位越来越高。

1 TNF-α结构及生物学特性

1.1 TNF-α结构肿瘤坏死因子多由激活的巨噬细胞、免疫细胞(B细胞和T细胞)等产生，主要分为TNF-α和TNF-β，TNF-α在总TNF的生物学活性中占主体部分，约占70%～95%，故目前提到的TNF多指TNF-α。TNF-α基因位于人的第6对染色体上，由4个外显子和3个内含子组成。TNF-α前体具有233个氨基酸，而成熟的TNF-α由157个氨基酸组合而成，相对分子质量为1.7×104。TNF-α为含有β折叠的非螺旋的蛋白质，由2个反向平行的β折叠组成，其形成的环状是来自于69位和101位的半胱氨酸所形成的二硫键连接而成[1]。TNF-α是通过其同源三聚体结构来发挥生物学功能。

1.2 TNF-α生物学特性TNF-α对类风湿关节炎、肝肾损伤衰竭、心血管疾病、胃肠道疾病、免疫系统等许多疾病有着重要的治疗意义，其中最重要的是对肿瘤的作用。TNF-α对肿瘤细胞的作用不是单一的，既可以促进肿瘤细胞增殖分化，也能抑制增殖、诱导肿瘤细胞凋亡。现代医学利用它可以诱导细胞凋亡这一生物学特性，展开了大量的研究和临床试验。TNF-α是在细胞各阶段病理生理过程中扮演重要角色的多功能性多肽类细胞因子，在参与细胞增殖、分化、侵袭、转移、凋亡的同时，还参与机体免疫应答及炎症反应等，TNF-α不仅具有细胞因子的特性，也是重要的免疫调节剂，通过调节一系列途径在典型的免疫反应中发挥重要作用，这些途径包括先天免疫参与的炎症反应，以及随后的增殖和程序性细胞死亡或坏死的细胞激活。临床试验证明TNF-α与化疗放疗药物联合应用时可产生明显的协同作用，为临床恶性肿瘤用药提供新的着力点。

2 TNF家族受体

TNF家族中有许多成员都在细胞凋亡中发挥着重要的作用，配体与受体间相互作用导致细胞发生凋亡。TNF配体及其受体TNF受体(tumor necrosis factor receptor，TNFR)可分为两个互补的超家族，即TNF和TNFR，至今已发现19个配体和29个受体。TNF-α与其受体TNFR结合后，使TNF-α受体的胞内部分与肿瘤坏死因子受体1相关死亡蛋白(TNF receptor-associated death domain，TRADD)结合，从而激活肿瘤坏死因子受体相关因子2(TNF receptor-associated factor 2，TRAF2)和Fas相关死亡结构域蛋白(Fas associated protein with death domain，FADD) ，以激活更多的相关信号通路。

2.1 TNF超家族配体TNF超家族的配体成员主要是NF-κB配体的TNF-α、TNF-β、淋巴毒素-β(lymphotoxin-β，LTβ)、CD40L、FasL、CD30L、4-1BBL、CD27L和OX40L，TNF相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)、核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)、TNF凋亡微弱诱导因子(TNF-like weak inducer of apoptosis，TWEAK)、增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand，APRIL)、B细胞激活因子(B cell activating factor，BAFF)、血管内皮细胞生长抑制剂(vascular endothelial growth inhibitor，VEGI)、胞质素A(EDA-A1，EDA-A2)和GITRL[2]。

LTβ与TNF有较高的同源性，高表达于活化的T细胞表面的膜型淋巴毒素；CD40L又称肿瘤坏死因子相关激活蛋白(TNF associated activation protein，TRAP)，主要表达于活化的CD4+T淋巴细胞；FasL为Fas的配体，由胞膜外区、跨膜区和胞浆区组成，其与TNF的同源性主要表现在形成b 折叠股的序列，FasL只表达于活化T淋巴细胞，其它细胞如B细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等均不表达FasL；CD30L与TNF-α、 TNF-β和CD40L有明显的同源性，以三聚体形式存在；4-1BBL又名CD137L，表达于活化的巨噬细胞、CD40L活化的B细胞、活化的T细胞等活化的抗原呈递细胞表面，以三聚体或多聚体的形式存在；CD27L又名CD70，仅表达于活化的T细胞和B细胞中；OX40L又名CD134L，与TNF有15%的同源性，表达于活化的B细胞、成熟的树突状细胞、巨噬细胞等；TRAIL主要由NK细胞和巨噬细胞等免疫细胞表达，可以使免疫细胞杀伤癌变细胞或被感染细胞，能与死亡受体特异性结合，诱导肿瘤细胞的凋亡而对正常细胞无毒性，对机体免疫监控和肿瘤发生发展具有重要作用；RANKL又名TNF相关激活诱导细胞因子(TNF-related activation-induced cytokine，TRANCE)、骨保护素配体(osteoprotegerin ligand，OPGL)，在骨和淋巴多个组织器官中表达，是破骨细胞发生的关键因子；TWEAK是一种具有多种生物活性的可溶性因子，主要通过与成纤维细胞生长因子诱导14结合形成复合物发挥生物学效应；APRIL有膜结合型和可溶性两种活性形式，均可促进肿瘤细胞的增殖，在正常组织中表达很低，在肺癌、乳腺癌、结肠癌等肿瘤细胞和组织中高表达；BAFF是维持B细胞功能稳定的重要因子，对免疫反应的调节有重要作用，BAFF和APRIL均出现在自身免疫系统疾病中炎症部位；VEGIL又名TNFSF15，是血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的抑制剂，抑制VEGF的同时并不影响血管内皮细胞的正常机能，高表达于内皮细胞；LIGHT受体激活剂GITRL又称TNFSF18，是糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR)的配体，其胞浆区与OX40L有较高的同源性，主要表达于内皮细胞、B细胞、巨噬细胞等，在所有状态下的T细胞上均表达。

2.2 TNF受体超家族TNF-α通过与不同的受体结合参与不同的信号通路进而导致肿瘤细胞发生凋亡。TNF-α与TNFR结合来发挥不同的生物学功能。近年来研究证明，肿瘤坏死因子超家族存在着29个不同的受体，这些受体可按照胞质序列和信号传导特性被分为以下3类：第1类包括Fas、TNFR1、DR3、DR4(TRAILR1)、DR5(TRAILR2)和DR6，其共同点为在胞质尾部含有死亡结构域，对B、T细胞活化有负调控作用，通过配体与相应的受体相结合，从而招募含有死亡结构域的受体，诱导caspase活化，诱导细胞凋亡；第2类包括TNFR2、CD40、CD30、CD27、TNFR2-RP、LT-βR，OX40、4-1BB、BAFFR、BCMA、TACI、RANK、p75、LIGHTR、GITR、TROY、EDAR、EDA-A2R、RELT和Fn14，其共同点为在胞质尾部含有一个或多个TNF受体关联因子(TNF receptor-associated factor，TRAF)相互作用基序(TRAF-interacting motifs，TIM)，此类受体激活后可直接招募TRAF家族成员，从而激活下游相关信号通路，具有重要的免疫调节作用，协同促进B、T细胞活化；第3类包括DcR1、DcR2、DcR3和Opg，结构中无功能性结构域或基序，它们并不参与信号传导，但可与其他两类受体竞争性与相应配体结合[3]。

TNFR是I型跨膜蛋白，有TNFR1和TNFR2两种类型，均由信号肽、细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域组成，并且二者细胞外结构域的同源性达28%，但因二者细胞内氨基酸序列是否具有死亡结构域而不存在相似性。TNFR1存在于体内大多数细胞表面上，共有426个氨基酸；TNFR2多存在于造血细胞、免疫细胞和内皮细胞上，共有439个氨基酸。TNFR1和TNFR2因其结构的不同而具有不同的生物学特性，TNFR1主要为诱导细胞凋亡，介导炎症反应等，TNFR2主要为调控胸腺细胞、内皮细胞抑制造血等[4]。二者之间虽功能各有不同，却也不是完全各自独立，大多数生物学效应是由二者共同协作完成的。在人的血和尿中存在着一种可溶性肿瘤坏死因子受体(soluble TNF-α receptor，sTNFR)，sTNFR分为sTNFR-p55和sTNFR-p75，是分子量为3.0×104和5.0×104的一条多肽链，包含半胱氨基酸和葡萄糖胺，以及3个以上的N-连接的寡糖侧链。sTNFR能与TNF结合，但介导信号传递的功能消失[5]。

3 TNF-α抗肿瘤机制

3.1 诱导细胞凋亡凋亡是抗肿瘤最有效的方式之一，许多抗肿瘤药物在促进肿瘤细胞凋亡的同时还可抑制肿瘤细胞增殖。大量体内和体外实验研究均证明TNF-α能诱导正常细胞增殖、分化，抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞发生凋亡。与TNF-α诱导肿瘤细胞发生凋亡有关的信号通路主要有以下3个：caspase介导的信号通路、NF-κB激活的信号通路、JNK信号通路。

Caspase的活化是诱导细胞发生凋亡的一个重要环节。募集到TNFR1的TRADD借助其聚集的死亡结构域与FADD的C端死亡结构域结合，而后FADD被募集到TNFR1复合物中。诱导凋亡的caspase家族信号通路可被位于FADD N端的死亡效应结构域(death effector domain，DED)所激活，从而激活上游的启动子caspase-8，caspase-8自活化后通过级联扩增反应，从而直接激活下游的caspase-3、6、7，激活后的caspase-3等能裂解修复DNA分子、凋亡抑制效应蛋白、细胞外基质蛋白和细胞骨架蛋白等，进而促使肿瘤细胞凋亡[6]。

c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNKs)家族是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中的重要一类，它主要被细胞因子和来自周围环境中的应激反应所激活，并在细胞增殖、细胞分化、细胞死亡和应激等一系列细胞调节活动中发挥作用。TNF-α刺激细胞后，JNK信号途径通路组成：MAPKKKS→MAPKKS→MAPKS。完整的MAPKKKS发挥抑制凋亡的作用，MAPKKKS作为caspase-3众多底物中的一员可被caspase-3切割并释放出C-末端的催化活性结构域，这时，MAPKKKS则改变为促进凋亡的效果[7]。MAPKKKS是信号转导中的重要节点，为肿瘤研究方面提供了潜在的靶点。

NF-κB是一类具有多向转录调控作用的核蛋白因子，被激活后参与基因的转录调控，在免疫、炎症、应激、细胞增殖和细胞凋亡等病理生理过程中均发挥重要的作用。在静息的细胞中，NF-κB和IκB可形成复合体，在胞浆中以非活化的无活性形式存在。细胞接收TNF刺激后，TNF通过IKK激酶复合体使IκBα蛋白的Ser32和Ser36或IκBβ的Ser19和Ser23两个位点磷酸化，泛素连接酶可辨别磷酸化的IκBα或IκBβ亚基，泛素化IκBα和IκBβ中的Lys21、Lys22，然后被S26蛋白酶复合体辨别并快速降解，NF-κB的C末端的核定位信号被暴露，开始核内起始转录，诱导多种凋亡抑制因子的表达[8]。NF-κB分子从胞质向核内的转移是这一复杂过程的关键。

3.2 参与机体免疫应答受遗传及环境等因素的影响，TNF/TNFR不仅在细胞生长、增殖、凋亡等过程中发挥作用，还参与免疫系统的调节，来影响肿瘤的增殖和凋亡。大多数恶性肿瘤的发生都与外坏境和内环境的改变有关，而环境的变化又多与炎症的发生密切相关。TNF-α在诱导细胞凋亡的同时也是一种重要的炎症因子，是白细胞致热源，参与机体的多种炎症反应，在细胞免疫中TNF-α发挥作用是通过细胞与细胞之间相互接触，促使巨噬细胞等激活T细胞介导的免疫作用来杀伤细胞，而在体液免疫中是通过促进B细胞的增殖分化，产生肿瘤的特异性抗体，发挥体液免疫协助抗肿瘤作用的。大多数癌症病情的发生发展及预后均与机体的免疫系统情况相关[9]。TNF-α是典型的促炎因子，TNF-α可通过增强机体免疫系统功能来协助肿瘤患者的治疗及预后，在类风湿关节炎、强直性脊柱炎和银屑病等许多自身免疫系统疾病中也起到重要的作用，为临床用药提供靶点。重要器官损伤或呼吸衰竭的患者体内的TNF-α水平也会急剧升高，这可能由于机体在应激状态下会发生内分泌调节紊乱和激素水平异常改变而导致的。

3.3 肿瘤血管系统功能方面的影响VEGF是具有高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，可促进血管内皮细胞增殖、增加血管通透性，故又称血管通透因子。VEGF须依靠TNF-α才能调节血管内皮高度渗透性的状态，TNF-α可通过促进VEGF的表达来提高肿瘤细胞生长，VEGF还可以加速淋巴管的形成导致肿瘤病灶向淋巴发生转移[10]。sTNF-α可依靠细胞骨架的重排和细胞内通道新建或重建使肿瘤血管内皮细胞的屏障功效破坏，引起肿瘤血管的渗透性升高，使化疗药物或其他肿瘤药物更准确的到达肿瘤局部范围中，在减少给药剂量提高药物疗效的同时也降低药物的毒副作用。TNF-α可促进肿瘤组织血栓的形成，从而引起血流变慢血液供应减少，血管壁形态改变等。大多数恶性肿瘤的血管分布密集且生长迅速，TNF-α抗血管生成活性较强，可阻碍新血管形成，这一特性可明显阻滞肿瘤组织的发生发展及转移扩散[11]。单一的影响肿瘤血管系统未必会达到理想的效果，与免疫应答方面联合应用可能在肿瘤治疗中发挥更大的作用。

3.4 诱导细胞程序性坏死细胞程序性坏死(programmed necrosis，necroptosis)是近年来发现一种受信号分子调控的细胞程序性死亡的方式，死亡细胞出现细胞器肿胀、细胞膜破裂等典型的坏死特征。TNF-α诱导细胞程序性坏死近年来也逐渐被大家所关注，是一种经典的程序性坏死。TNF-α与TNFR结合后，与受体相互作用蛋白激酶(receptor-interacting proteins kinase，RIPK)1和TRADD等相关蛋白结合并形成复合体，RIPK1从复合体上解离并与RIPK3结合，二者磷酸化后被激活，继而招募并使下游的混合系列蛋白激酶样结构域蛋白(mixed lineage kinase domain like protein，MLKL)磷酸化。活化的MLKL形成四聚体与细胞膜上的磷脂酰肌醇结合，使细胞膜结构被破坏，导致细胞发生程序性坏死[12]。研究发现，在人结肠癌HT-29细胞中敲出MLKL后，TNF所诱导的细胞坏死明显被抑制，且活性氧的产生也随之减少，表明MLKL是程序性坏死中关键的节点[13]。细胞程序性坏死与肿瘤细胞的发生发展密切相关。研究发现RIPK3在肺癌和结肠癌中明显增多，表明RIPK3可能具有诱导细胞死亡的能力。RIPK3能够显著抑制caspase-8的活性，使肝细胞发生程序性坏死，抑制肝癌细胞的增殖。顺铂通过RIPK3和TNF-α的自分泌产生，促使凋亡抗性食管癌细胞发生程序性坏死，从而增加顺铂敏感性[14]。

4 TNF与癌症之间的关系

4.1 乳腺癌中国女性乳腺癌的发病率和死亡率在全球中处于较低水平，但是发病人数占全球的11.2%，时刻威胁着女性的生命安全。乳腺癌患者体内的癌细胞分泌的TNF-α可以通过NF-κB依赖性的抗细胞凋亡分子来促进肿瘤细胞的存活与增殖，我们可以通过抑制NF-κB信号通路来促使乳腺癌细胞发生凋亡。在身体健康未患乳腺癌的女性血清中检测不到TNF-α的含量，但在乳腺癌患者体内呈高表达。乳腺癌分期越高，血清中TNF-α的水平也越高；乳腺癌发生转移的患者TNF-α水平也显著高于未发生转移病灶的患者，65%～75%的乳腺癌晚期患者最终发生骨转移，骨转移的患者血清中TNF-α水平最高；乳腺癌术后病情复发，患者的TNF-α也明显高于未复发健康状况良好的患者[15]。在乳腺癌中，TNF-α的高表达与肿瘤的分级和转移情况没有直接相关性。TNF-α对不同类型的乳腺癌细胞株可发挥不同的作用。TNF-α通过调节酸性鞘磷脂酶及神经鞘氨醇激酶1的表达水平来调控神经酰胺的产生，从而影响不同乳腺癌细胞株的增殖：对于雌激素受体阳性乳腺癌细胞株MCF-7而言TNF-α可以抑制增殖、促进凋亡，但作用于ER阳性且侵袭能力强的MDA-MB-231乳腺癌细胞株时，TNF-α可呈时间-剂量依赖性的促进细胞增殖[16]。TNF-α抑制剂英夫利昔单抗主要用于治疗类风湿关节炎，同时具有抑制肿瘤转移的特性，可显著降低乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭和迁移。

4.2 胃癌胃癌是消化道类恶性肿瘤中最常见的疾病。胃癌的发生、发展均与患者机体免疫功能紊乱有关，随着患者病情加深加重，机体的免疫功能也逐渐降低。大量的TNF-α由肿瘤细胞自分泌或旁分泌产生，患者血液中TNF-α过多，对机体各方面产生不可避免的损害，胃癌三期和四期的患者多数已出现其他组织和免疫器官的转移，对免疫系统产生危害，机体免疫系统功能显著降低。TNF-α在促进胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移的同时，也能产生细胞毒作用。TNF-α在胃癌组织中由于分化程度的不同而有很大的差异，早期胃癌患者血清中TNF-α的含量与晚期胃癌患者血清中含量相比较含量很少。实验表明，TNF-α水平异常升高会导致胃癌患者免疫系统紊乱，多引起患者体温升高，心、肾及消化道功能障碍，最终引起恶性病变而死亡。TNFR对TNF-α有极强的亲和力的同时在肿瘤血管内皮细胞多呈现高表达。当胃癌组织血管内TNF-α增多时，TNF-α可与血管内皮细胞TNFR1结合，增加了血管通透性，使血液中的其他类型细胞透过细胞膜而溢出，血管内失去大量红细胞导致肿瘤组织发生出血现象而坏死[17]。TNF-α作为药物靶点，能够发挥抗癌作用。HUHS1015是萘哌地尔类似物，能诱导多种肿瘤细胞凋亡，HUHS1015能增加胃癌细胞内TNF-α表达，激活TNF-α/TNFR1信号通路，引起下游caspase级联反应的发生[18]。

4.3 肝癌肝癌分为原发性肝癌和转移性肝癌两种，原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一。TNF-α可以通过内质网应激信号通路来诱导肝癌细胞发生自噬并促进细胞增殖，且肝细胞癌患者病灶组织中TNF-α的表达量均高于正常人肝组织。内质网应激是由真核细胞内质网腔内错误折叠或未折叠蛋白聚集，或钙离子平衡紊乱引起，对于调控肝癌细胞的增殖、凋亡发挥着重要的作用。在肝癌细胞发生、发展的过程中，炎症反应也是不容忽视的原因之一，慢性炎症长期且持续性的发生会促进肝细胞发生癌变，TNF-α在其中也充当了重要的角色。TNF-α与肝衰竭、肝硬化、炎症性肝损伤、病毒性肝炎、酒精性肝炎等的肝部疾病的发生发展均存在一定关系，这些患者的TNF-α水平与正常人相比均显著性的升高。TNF-α通过活化NF-κB信号通路，诱导周期相关蛋白表达，改变细胞周期进程，也可通过激活NF-κB信号通路抑制肝癌细胞的侵袭和迁移[19]。以H22肝癌荷瘤小鼠为研究对象，研究八月札对其免疫功能的影响发现，八月札可以抑制肝癌组织的生长，且显著提高荷瘤鼠血清中IL-2和TNF-α水平，表明八月札的抗肿瘤活性可能与过提高荷瘤鼠血清TNF-α水平进而促进肿瘤细胞的变性坏死，达到阻止其生长的作用[20]。

5 肿瘤坏死因子在肿瘤治疗方面的应用

5.1针对TNFSF相关的肿瘤治疗 TRAIL可以特异性的诱导肿瘤细胞凋亡，针对这一特性，国内外对TRAIL和其激动剂进行了深入研究。紫杉醇、吉他西滨等化疗药物均可增加肿瘤细胞对TRAIL的敏感性。利用计算机分子模拟技术对TRAIL的结构进行优化改造，得出特异性和生物活性均较高、可特异性与DR4或DR5结合的TRAIL变体，从而使TRAIL发挥出更强的抗肿瘤活性[21]。CD30配体可以对CD30+的血液肿瘤细胞通过激活NF-κB产生不同的生物效应，阻断这条通路的CD30 抗体在体外实验中已证实对到霍奇金淋巴瘤细胞和间变性大细胞淋巴瘤细胞有抑制生长和诱导凋亡的作用，现已应用于复发的霍奇金淋巴瘤的Ⅱ期临床试验中，并显示出初步疗效[22]。

5.2 针对TNFRSF相关的肿瘤治疗DcR3是近年来发现的TNFR家族的新成员，是一种细胞凋亡抑制剂，对细胞凋亡起负调控作用，高表达于某些肿瘤及自身免疫性疾病中，肝癌细胞中DcR3表达增加，DcR3诱导细胞骨架重塑，抑制E-钙黏蛋白表达，并促进了肝癌细胞迁移，结果提示DcR3可能是癌症治疗的潜在靶标[23]。许多研究证明，通过调节免疫反应可以适当提高晚期癌症患者的总体存活率。在小鼠癌症模型中，在接受抗TNF药物治疗的小鼠或TNFR2基因敲除小鼠中，骨髓来源的抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)数量减少，从而使肿瘤生长减慢或受到抑制，这表明TNF增加了抑制肿瘤免疫的MDSCs的存活及募集。在黑色素瘤小鼠模型中，注射TNF后通过增加调节性T细胞(regulatory cells，Tregs)作用于表达TNFR2的造血细胞而促进肿瘤转移，在结直肠癌和肝癌的小鼠模型中也可观察到相似的作用机制[24]。用特异性抗靶向TNFR2可抑制卵巢癌细胞和Tregs的增殖，在晚期Sèzary综合征中TNFR2拮抗抗体可杀伤表达TNFR2的肿瘤细胞和Tregs。在自身免疫模型中，TNFR2已被证明能够促进T细胞功能和调控患病机体免疫功能[25]。

6 展望

TNF-α在细胞凋亡、免疫反应中都扮演着至关重要的角色，许多疾病可以此为靶点进行特异性的治疗。TNF在临床上是一类生物反应调节剂，多作为抗肿瘤药物来使用，同时因其研究还不是很透彻，若应用不当对机体产生的伤害也是不容忽视的，为了使其更好的发挥抗肿瘤作用，减少不良反应的发生，为肿瘤患者带来新的生机，我们在科研与临床中都投入了大量的精力，在肿瘤细胞类型、肿瘤分期、年龄及身体素质等各种存在差异的情况下TNF-α相关激动剂和抑制剂应运而出，对差异性的个体有针对性的进行治疗。尽管如此，TNF-α的生理病理过程、具体机制还不是很明朗，我们还需通过后续的实验研究来更加深入的了解TNF-α的相关内容，为科研及临床肿瘤患者带来新的曙光。