米槠人工林土壤微生物群落组成对凋落物输入的响应

卢胜旭， 许恩兰， 吴东梅， 陆宇明， 郭剑芬, 杨玉盛

(1.福建师范大学湿润亚热带生态地理过程教育部重点实验室, 福建 福州 350007；2.福建师范大学地理研究所, 福建 福州 350007)

土壤微生物作为分解者，在森林生态系统养分循环中扮演着重要的角色；而土壤微生物群落组成受到森林净初级生产力、植物碳分配、根际活动和凋落物输入量等的共同影响[1]。其中凋落物输入是森林土壤碳(C)、氮(N)库的重要来源[2]，且调控土壤微生物的生理和代谢过程[3]。因此凋落物输入量的微小变化都会引起土壤微生物群落生物量、结构和活性的变化[4]。

当前不断加剧的气候变化对植物净初级生产力产生了积极或消极的影响。如CO2升高[5]、氮沉降[6]和温度增加[7]均对植物生产力有促进作用，而O3升高[8]、干旱[9]和酸沉降[10]普遍降低了生产力。初级生产力的变化可能会引起地上凋落物输入的数量和质量发生变化，从而改变凋落物层的物理、化学和生物特性，进而影响土壤微生物生物量、群落结构和活性。虽然有关凋落物变化对土壤微生物影响的研究较多，但并未能达成一致的认识。PREVOST-BOUREetal[11]研究表明凋落物输入处理对土壤微生物生物量的影响不显著，另外还有研究结果表明凋落物输入处理影响土壤微生物生物量和活性，还会影响其群落组成[12-13]。可见，土壤微生物对凋落物输入变化响应仍存在不确定性，因此有必要开展更进一步的研究。

我国中亚热带地区常绿阔叶林是全球同纬度的“绿洲”，其生物量和生产力非常高，对全球陆地生态系统碳吸存有着极其重要的贡献[14]。该地区常绿阔叶林年凋落量大，约可达11 t·hm-1·a-1，这为土壤微生物提供了丰富的底物来源。为了深入研究地上凋落物输入对土壤微生物的影响，本研究以三明市格氏栲自然保护区米槠[Castanopsiscarlesii(Hemsl.) Hayata]人工林为研究对象，通过磷脂脂肪酸(Phospholipid fatty acid， PLFA)技术分析该人工林凋落物加倍与去除处理的土壤微生物群落组成的差异，并分析主要影响因素，有助于深入理解全球气候变化背景下凋落物输入变化对该地区森林土壤养分循环的影响机制。

1 研究区概况

研究区域位于福建省三明市格氏栲自然保护区(117°28′E， 26°11′N)，海拔305～315 m，坡度15°～20°。该保护区属中亚热带季风气候，具冬冷夏热、水热同期、湿润多雨等特点，年均气温20.1 ℃，年均降水量1 670 mm。土壤为砂岩发育的山地红壤，表层疏松，土层深厚。本试验研究的米槠人工林前身为米槠[Castanopsiscarlesii(Hemsl.) Hayata]天然林，20世纪60年代经皆伐、火烧、挖穴后造林和幼林抚育而形成，其林下植被主要有硃砂根(ArdisiacrenataSims)、香花崖豆藤(MillettiadielsianaHarms)、狗骨柴 [Diplosporadubia(Lindl.) Masam.] 和黄楠 (MachilusgrijsiiHance) 等。

2 研究方法

2.1 土壤样品采集

2012年6月，在亚热带米槠人工林设置3个大小为20 m × 20 m的样方，分别在各样方内随机设置3个1 m × 1 m的小区，分别作如下处理，即：(1)保留凋落物(control treatment， CT)，不做任何处理；(2)去除凋落物(no litter， NL)，在小区上方0.5 m高处放置1.5 m × 1.5 m大小的正方形尼龙网去除小区地表全部凋落物；(3)凋落物加倍(double litter， DL)，将NL处理截留的凋落物移至添加凋落物处理的小区内。每种处理设 3个重复，共9个小区。

2017年11用内径2 cm的土钻采用“S”型混合采样方法取样，采集各小区0～10 cm土层土样，5根土芯混成一个混合样，使用塑料自封袋保存，运回福建三明生态系统与全球变化研究站实验室，挑除肉眼可见的砾石和动植物残体后充分混匀。其他原状土样过2 mm(孔径)筛后再分成3部分：第一部分保存于-20 ℃环境，用于土壤微生物指标测定；第二部分保存于4 ℃环境，用于测定土壤的基本理化性质等；第三部分自然风干，用于测定土壤有机碳、全氮、pH值等。

2.2 土壤理化性质测定方法

2.3 土壤微生物生物量碳、 氮及微生物群落结构测定

采用氯仿熏蒸-浸提法测定土壤微生物生物量碳(microbial biomass carbon， MBC)、微生物生物量氮(microbial biomass nitrogen， MBN)[15]。简要步骤如下：称取两份5 g鲜土，一份用氯仿熏蒸24 h，另一份不作处理；然后按1∶4 (土∶溶液)比例用0.5 mol·L-1K2SO4溶液浸提，滤液经振荡、离心、过滤后使用总有机碳分析仪(TOC-VCPH， Shimadzu)测定有机碳含量，使用连续流动分析仪(Skalar San++， Netherlands)测定有机氮含量。计算公式如下：

CMBC/(mg·kg-1)=EC/kEC

(1)

CMBN/(mg·kg-1)=EN/kEN

(2)

其中：EC为熏蒸和未熏蒸处理的有机碳含量的差值，kEC是MBC的浸提系数0.45；EC为熏蒸和未熏蒸处理的有机氮含量的差值，kEN是MBN的浸提系数0.54。

微生物磷脂脂肪酸(PLFA)的提取参考BUYERetal[16]的方法，调整后的简要步骤如下：

① 取3 g冻干土置入25 mL特氟龙管，加入4 mL 50 mmol·L-1磷酸缓冲液(pH值=7.4)、10 mL甲醇和5 mL氯仿，室温下超声10 min、避光振荡2 h、离心(2 500 r·min-1)10 min。

② 液相移入干净的特氟龙试管，加入3 mL氯仿和3 mL磷酸缓冲液，涡旋混匀，静置过夜分层。

③ 底部液相用N2吹干，加入适量氯仿，洗入已用5 mL氯仿润洗后的萃取小柱中，依次加入5 mL氯仿和10 mL丙酮洗去中性脂和极性脂，收集用5 mL甲醇洗脱的磷脂，最后用N2吹干。

④样品中加入1 mL 1∶1(甲醇∶甲苯)溶液、1 mL 0.2 mol·L-1甲基化KOH，涡旋后37 ℃水浴15 min，加入2 mL正己烷、0.3mL 1 mol·L-1冰醋酸和2 mL无菌水，涡旋后离心分层，吸取顶部液相，残液再加2 mL色谱纯正己烷提取，然后合并收集的顶部液相用N2吹干，收集N2，封口膜密封，置于-20 ℃保存。

上机测样前，用200 μL含有19∶0甲酯的内标液将样品洗入GC小瓶，用GC-MIDI系统进行磷脂脂肪酸的鉴定。计算采用19∶0内标法，每单位干土所含脂肪酸含量nmol·g-1。具体的土壤微生物种群磷脂脂肪酸标志物及其特征比值详见表1[17-21]。

表 1 土壤磷脂脂肪酸标志物Table 1 Markers of PLFA in soil

2.4 数据处理

数据经过Microsoft Excel 2013软件整理后，采用SPSS 21.0统计软件对土壤各指标进行统计分析。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验不同处理之间土壤理化性质，土壤微生物生物量及群落组成的差异。采用Canoco Software 5.0软件，以土壤微生物PLFA为响应变量，以土壤理化性质及微生物生物量为解释变量做冗余度分析(redundancy analysis， RDA)；绘图由Origin 9.0软件完成。

3 结果与分析

3.1 土壤基本理化性质

由表2可以看出，与对照处理相比(CT)，加倍凋落物处理(DL)显著提高铵态氮和硝态氮含量(P<0.05)，而去除凋落物处理(NL)显著降低了硝态氮含量(P<0.05)。DL处理土壤全氮、铵态氮和有效磷含量显著高于NL处理(P<0.05)。不同凋落物输入处理下土壤有机碳和可溶性有机碳含量差异不显著。DL和NL处理下土壤pH值(表2)和土壤微生物生物量碳含量(图1)均明显高于CT，可溶性有机氮(表2)和微生物生物量氮含量均显著低于CT(图1)。而微生物生物量碳氮在DL和NL处理之间差异不显著。

表 2 不同凋落物量输入处理土壤基本理化性质Table 2 General characteristics of soil under different litter input treatments

3.2 土壤微生物磷脂脂肪酸含量

DL处理不同程度增加了土壤各类微生物PLFA组成的含量，而NL处理则反之(图2)。具体表现为，DL处理土壤丛枝菌根真菌(AMF)、革兰氏阳性菌[G(+)]、革兰氏阴性菌[G(-)]、放线菌(ACT)、真菌(F)、总磷脂脂肪酸(TPLFA)含量均显著高于NL处理(P<0.05)，但与CT处理差异不显著。同DL处理土壤相比，NL处理土壤显著提高了G(+)∶G(-)比值(P<0.05)，但与CT处理差异不显著。凋落物输入变化中F∶B比值随凋落物去除而升高，表现为NL处理明显高于CT和DL处理的土壤F∶B比值(P<0.05)。

注： 不同小写字母表示处理间差异显著， P<0.05。Notes: different lowercase letters indicate significant difference among treatments， P<0.05.图 1 不同凋落物量输入处理土壤微生物生物量碳氮含量Figure 1 Soil microbial biomass carbon and nitrogen contents at different litter input treatments

注： 不同小写字母表示处理间差异显著， P<0.05。Note: different lowercase letters indicate significant difference among treatments， P<0.05.图 2 不同凋落物量输入处理土壤磷脂脂肪酸含量及其特征比值Figure 2 Different litter quantity input on soil phospholipid fatty acids and their characteristic ratios

3.3 土壤微生物群落组成变化的冗余度分析

图 3 土壤微生物群落组成与环境因子的冗余度分析Figure 3 Redundancy analyses of soil microbial community composition and environmental factors

4 讨论与结论

4.1 土壤理化性质对凋落物输入变化的响应

凋落物输入是土壤元素循环利用的关键过程[25]。本研究中加倍凋落物处理对土壤SOC和DOC含量没有明显影响(表1)。这可能由于凋落物加倍为微生物提供了丰富的底物来源，对土壤有机质产生“正激发效应”，从而提高了微生物对土壤SOC和DOC的分解，使加倍凋落物处理与对照处理SOC和DOC差异不显著[26]。也可能由于土壤DOC随季节变化较大[27-28]，而本研究取样的季节为秋季，此时降雨较少，淋溶作用弱。不同的是，本研究凋落物加倍处理显著提高了土壤TN、铵态氮和硝态氮含量，而凋落物去除降低了硝态氮含量，表明凋落物增加或减少显著影响土壤N的有效性，这与我们前期研究一致[29]。

土壤微生物在土壤养分的获取和转移中起着重要的作用[30]。有研究表明，凋落物添加与去除明显改变了土壤微生物生物量碳(MBC)含量[31-32]。本研究凋落物加倍处理下土壤MBC含量增加31.44%，这与HOOKER和STARK[33]在美国怀俄明州3个不同生态系统的研究结果类似，他们发现添加凋落物使土壤MBC含量增加13%。但亦有学者研究显示，添加或去除凋落物对土壤MBC含量没有显著影响[34]。不同研究结果差异可能与所处气候、森林类型、土壤状况、凋落物输入量差异等有关。其原因可能在于温带森林对凋落物的处理往往不如热带和亚热带森林敏感，这是由于温带森林土壤C循环速度较慢，导致微生物生物量和活性较低。也可能由于森林类型不同，对比杉木而言，本研究凋落物为米槠叶(低C /N、 低木质素/N、 低纤维素含量)，这些高质量的有机质输入添加使土壤微生物更容易利用的植物碳来源增加[35]，从而使微生物生物量碳增加。

4.2 土壤微生物群落组成对凋落物输入变化的响应

F∶B和G(+)∶G(-)的比值常被用作指示微生物群落结构变化的重要指标，F∶B可表征真菌和细菌两个种群的相对丰富程度消长状况[39]。细菌分解主要发生在养分充足的土壤中，这些土壤富含容易分解的有机质，碳周转和养分循环速度较快；而真菌分解为慢周转方式，多存在于酸性土壤中，偏好低营养、以及高碳氮比的有机物[40]。当易分解有机质输入减少使土壤微生物更容易利用的植物碳来源减少，微生物需要转而利用土壤中较难利用的碳组分，此时真菌相对细菌的优势显著[36]。在本研究中，去除凋落物时，F∶B的比例显著增加(图2)，NL处理的F∶B为0.19，而CT和DL处理的F∶B分别为0.16和0.15，表明去除凋落物后土壤微生物由细菌分解型转换为真菌分解型。WANGetal[41]研究表明，亚热带针叶林的NL处理的F∶B高于CT和DL处理。

G(-)和G(+)是微生物群落结构变化的指示器，在不同的环境变化下，养分的倾向性和生长策略不同[42]。G(-)更加依赖于新鲜有机质的输入，而G(+)更倾向于养分有效性低的环境中生长[43]。在本研究中，NL处理的真菌和细菌含量显著低于DL处理(图2)，表明去除凋落物对微生物群落有抑制作用。但NL处理的G(+)∶G(-)的比值却显著上升，因为G(-)更依赖于易分解的C源，生长较快，去除凋落物减少了新鲜有机质的输入，为了适应有效养分减少的限制，NL处理下的微生物细菌群落发生了转移。