酶法改性谷朊粉工艺优化

吴雷，黄娟

江苏旅游职业学院烹饪工艺与营养学院（扬州 225127）

生物酶法是一种有效提高植物蛋白性能的手段。李占方等[1]通过生物酶法进一步提高蛋白产品特性，并研究了酶处理对于样品内部化学键和蛋白质二级结构的变化规律。孟丹阳等[2]通过小麦面筋蛋白酶解过程中对其功能性质变化规律的研究，发现在相同的酶底物情况下，通过与中性蛋白酶、风味蛋白酶相比，碱性蛋白酶对小麦蛋白的酶解率最高。通过典型水解试验来确定常见六种蛋白酶中适宜作为谷朊粉水解的蛋白酶，再通过单因素试验和正交试验对其工艺进行了优化，得出最佳工艺。

1 材料与方法

1.1 材料

谷朊粉，购于山东渠风食品科技有限公司；木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、谷氨酰胺转氨酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶、氯化钠、浓硫酸，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要设备与仪器

SX-500型高压蒸汽灭菌锅，日本TOMMY公司；XW-80漩涡混合器，上海医大仪器厂；TG 16-WS台式高速离心机，长沙湘智离心机仪器有限公司；UV-7504 C型紫外可见分光光度计，上海欣茂仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 酶解液的制备

水解条件参考刘大川等[3]、张祥奎等[4]的方法并稍做修改。水解步骤如下：在烧杯内加入4 g谷朊粉蛋白质粉，加入200 mL缓冲溶液PBS，充分搅拌使其完全溶解，然后放入沸水内使其蛋白质变性利于后期酶解，酶解时间约10 min，然后取出将其温度降至所需温度。将酶解样液pH调至7.0，温度控制在55 ℃，按（1 g︰1 000 U）酶活一定加入一定量的木瓜蛋白酶；样液pH调至2，温度控制在37 ℃，按（1 g︰1 000 U）酶活一定加入一定量的胃蛋白酶；将样液pH调至6，温度控制在55 ℃，按（1 g︰1 000 U）酶活一定加入一定量的谷氨酰胺转氨酶；将酶解样液pH调至8，温度保持在55 ℃，按（1 g︰1 000 U）酶活一定加入一定量的碱性蛋白酶；将酶解样液pH调至7.5，温度控制在40 ℃，按（1 g︰1 000 U）酶活一定加入一定量的中性蛋白酶；将酶解样液pH调至6.5，温度保持在55 ℃，按（1 g︰1 000 U）酶活一定加入一定量的风味蛋白酶。待酶反应完毕后，95 ℃保温10 min以终止酶反应。在酶反应器中进行酶解的整个过程，且通过酸碱滴定控制pH。将所有最终水解液的pH调节至7.0，并在4 ℃，8 000 r/min转速下离心15 min，收集上清液。

1.3.2 谷朊粉蛋白酶的筛选方法

分别用谷氨酰胺转氨酶（G）[5]、胃蛋白酶（P）[6]、风味蛋白酶（F）[7]、木瓜蛋白酶（Pa）[8]、碱性蛋白酶（N）[9]、中性蛋白酶（D）[10]，在其推荐最适条件下对谷朊粉进行酶解，并测定酶解物的水溶性蛋白质含量和DH。

1.3.3 酶解改性谷朊粉工艺优化方法

1.3.3.1 酶解初始工艺

在容量为1 000 mL的三角瓶中加入100 g谷朊粉，瓶口用纱布封住，在121 ℃环境下灭菌20 min，将温度降至常温后备用。在谷朊粉溶液浓度8%、酶解时间4 h、pH 8.5、加酶量0.8%及酶解温度55 ℃（恒温水浴锅）的条件下进行水解，并用0.1 mol/L的NaOH使pH维持在8.5左右。酶解反应结束后，将试管迅速转移至沸水中加热钝化蛋白酶，加热时间5 min。通过喷雾干燥机对改性谷朊粉进行干燥，用100目网筛将谷朊粉过筛后待用。

1.3.3.2 酶解改性谷朊粉工艺优化方法

1.3.3.2.1 单因素优化方法

以酶解改性后谷朊粉水溶性蛋白质含量和DH为指标，对影响谷朊粉酶解的因素进行单因素分析，对酶解温度、酶解时间、pH、底物浓度、加酶量五个因素进行考察试验，具体处理方法如下：

酶解温度优化：将酶解液、谷朊粉及水混合物置于恒温水浴锅中水浴，温度分别控制在33，37，40，55和60 ℃，其余条件同初始工艺。以谷朊粉水溶性蛋白质含量和DH为评价指标，确定最适酶解温度。

底物浓度优化：将谷朊粉分别与酶解液和水混合后置于恒温水浴锅中水浴，其浓度分别为5%，10%，15%，20%及25%，其余条件同初始工艺。以谷朊粉水溶性蛋白质含量和DH为评价指标，确定最适底物浓度。

加酶量优化：将浓度为2%，3%，4%，5%及6%的酶解液分别与谷朊粉和水混合后置于恒温水浴锅中水浴，其余条件同初始工艺。以谷朊粉水溶性蛋白质含量和DH为评价指标，确定最适加酶量。

酶解时间优化：将酶解液、谷朊粉及水混合物分别于恒温水浴锅中水浴0，0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4和4.5 h，其余条件同初始工艺。以谷朊粉水溶性蛋白质含量和DH为评价指标，确定最适酶解时间。

酶解pH优化：将酶解液、谷朊粉及水混合物分别在不同pH（6，6.5，7，7.5，8.0，8.5及9.0）条件下于恒温水浴锅中水浴，其余条件同初始工艺。以谷朊粉水溶性蛋白质含量和DH为评价指标，确定最适酶解pH。

1.3.3.2.2 正交试验方法

因素水平设计：依据单因素试验分析结果，从而选择对试验结果影响较大的因素和较适宜的试验水平，采用L16(45)正交表（表1）进行正交试验。

最佳工艺条件验证：通过单因素试验和正交试验得出的最适条件进行酶解验证。

表1 正交试验因素水平表

1.3.4 酶解谷朊粉水溶性蛋白的测定方法

根据 GB 5009.5—2016[11]，使用 Foss 5800 Kjeltec凯式定氮仪测定样品蛋白质含量和水溶性蛋白含量，蛋白系数为5.7[12]。

1.3.5 酶解谷朊粉DH的测定方法

试验采用TNBS法[13]测定水解度。参考Adler-Nissen等[14]、周慧江等[15]的方法并略作修改。

L-亮氨酸溶液的配制： 精确称取0.12 mg L-亮氨酸，用1% SDS水溶液溶解并定容到500 mL容量瓶中，此标准溶液的L-亮氨酸含量约为0.24 g/L。取0，2.5，5.0，7.5和10.0 mL的L-亮氨酸标准溶液，分别与10，7.5，5.0，2.5和0 mL的1% SDS混合，使配置好的L-亮氨酸溶液浓度分别为0，0.6，0.12，0.18和0.24 mg/L。

L-亮氨酸溶液标准曲线绘制：取2 mL的磷酸盐缓冲液于试管，并向其加入250 μL的L-亮氨酸溶液和2.0 mL TNBS溶液。摇匀后在50 ℃水浴保温，避光振荡60 min[16]。振荡结束后，加入4 mL的0.1 mol/L HCl中止反应，室温下冷却30 min，在340 nm处测定吸光度。

以发酵时间为横坐标，以不同浓度对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

样品中DH的测定：取250 μL水解样加入到试管中，加入2.0 mL磷酸盐缓冲液，再加入2.0 mL TNBS溶液，摇匀。在50 ℃水浴保温，避光振荡60 min。振荡结束后，加入4 mL的0.1 mol/L HCl中止反应，在室温下冷却30 min，在340 nm处测定吸光度。

按式（2）计算水解度：

式中：AN1为蛋白水解前氨基氮含量，mmol/g蛋白；AN2为蛋白水解后氨基氮含量，mmol/g蛋白；NPb为蛋白底物中肽键氮含量，mmol/g蛋白，即蛋白氮。

2 结果与分析

2.1 谷朊粉蛋白酶的筛选结果

将谷朊粉的浓度控制在10%作为酶解底物，采用6种酶（谷氨酰胺转氨酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶及中性蛋白酶）分别在其最适条件下对谷朊粉进行典型水解试验。以水溶性蛋白含量及DH为检测指标来筛选最佳的酶对谷朊粉进行酶解改性。

从图1可以看出，六种酶在其最适条件下，它们的水溶性蛋白质含量和DH有着明显的区别。其中，谷氨酰胺转氨酶（G）、胃蛋白酶（P）、风味蛋白酶（F）、木瓜蛋白酶（Pa）四种酶酶解谷朊粉之后底物中水溶性蛋白质的含量和DH含量并不突出，而碱性蛋白酶（N）和中性蛋白酶（D）两种酶水解效果较好，水溶性蛋白质含量分别为43.98%和18.36%，DH分别为40.17%和15.64%，但N的水解效果略高于D，因此，后续试验选择N作为酶解改性谷朊粉的蛋白酶。

注：酶：G（谷氨酰胺转氨酶）；P（胃蛋白酶）；F（风味蛋白酶）；Pa（木瓜蛋白酶）；N（碱性蛋白酶）；D（中性蛋白酶）；A，水溶性蛋白含量；B，DH；图中标注不同小写字母代表组内差异显著（p＜0.05），相同小写字母代表组内无显著性差异（p＞0.05）

2.2 酶解工艺的单因素优化结果

通过典型水解试验，以水溶性蛋白质和DH为指标，在六种蛋白酶推荐最适水解条件下酶解谷朊粉，经过分析选择了碱性蛋白酶作为水解谷朊粉的蛋白酶。

2.2.1 酶解温度优化结果

酶解温度对蛋白酶酶解谷朊粉具有很大的影响，因为蛋白酶都有其最适的温度。在碱性蛋白酶的最适温度下，随着温度的升高反应物的能量和分子间有效接触的频率增加，因而反应速度加快，其酶活性可以达到提高，水解效果得到提升；但如果温度过高，蛋白酶易变性失活，导致水解度下降。由图2可以看出，碱性蛋白酶酶解谷朊粉在不同温度的条件下具有明显的区别：30～40 ℃之间，水溶性蛋白质含量和DH的含量不高，即碱性蛋白酶在此段温度下活性不高；在55～60 ℃下，结果显示碱性蛋白酶活性较高，即碱性蛋白酶在此温度段较适应，水溶性蛋白质和DH含量在55 ℃时分别达到47.28%和25.84%，表明酶解谷朊粉具有较好的水溶性，故55 ℃为酶解谷朊粉最佳温度。

图2 酶解温度对酶解的影响

2.2.2 底物浓度优化结果

由图3可知，不同的底物浓度对发酵谷朊粉具有较大的影响。

结果显示：当底物浓度为10%时，碱性蛋白酶水解谷朊粉酶解底物中水溶性蛋白质和DH含量最高，分别为38.18%和22.18%，说明碱性蛋白酶水解谷朊粉在底物浓度为10%时具有较好的均匀分散性，水溶性较好；当底物浓度为15%～25%时，水溶性蛋白质和DH含量都不尽理想；当底物浓度较低时，碱性蛋白酶所接触的谷朊粉不够充分，水溶性蛋白质和DH含量不高。故酶解谷朊粉最佳底物浓度为10%。

2.2.3 加酶量优化结果

酶的加入量在谷朊粉酶解中具有重要作用，通过图4可以看出，2%的加酶量不能使谷朊粉较好酶解，水溶蛋白质和DH只有18.38%和7.82%，相较于4%的加酶量所得出的水溶性蛋白质含量和DH（分别为40.12%和22.13%）具有较大差距；当酶的添加凉量达到4%时，水溶性蛋白质含量和DH基本保持稳定。故酶解谷朊粉最佳加酶量为4%。

图3 底物浓度对酶解谷朊粉的影响

图4 加酶量对酶解谷朊粉的影响

2.2.4 酶解时间优化结果

由图5可知，随着酶解时间的延长，水溶性蛋白质含量和DH都呈现先上升后平缓的趋势。酶解时间在3.5 h之前水溶性蛋白质含量和DH都呈现迅速上升的趋势，说明酶解时间在3.5 h之前碱性蛋白酶在谷朊粉中活性较强；3.5 h之后呈现稳定趋势，在酶解后期所需要的营养物质已经消耗殆尽，所以之后水溶性蛋白质含量和DH基本保持稳定。故酶解谷朊粉最佳酶解时间为3.5 h。

图5 酶解时间对酶解谷朊粉的影响

2.2.5 酶解pH优化结果

由图6可知，中性和弱酸性的环境都不利于碱性蛋白酶的水解谷朊粉，弱碱性环境则更有利于碱性蛋白酶水解谷朊粉。通过试验结果可知，当酶解pH为8.0时酶解谷朊粉后水溶性蛋白含量和DH分别为40.41%和23.42%，酶解谷朊粉效果较好。故酶解谷朊粉最佳酶解pH为8.0。

2.3 酶解改性工艺的正交优化结果及验证

2.3.1 正交优化结果

根据上述单因素试验结果，以酶解时间（A）、酶解温度（B）、底物浓度（C）、加酶量（D）和pH（E）为因素，选取酶解后DH作为评价指标，采用L16(45)正交设计对工艺条件进行优化。

由表2可以得出，酶解后底物中DH高达34.18%，组合为酶解时间4 h、加酶量5%、酶解温度55 ℃、底物浓度10%、发酵pH 7.0。通过单因素试验可知，含水量太低使底物浓度增大，蛋白酶在底物中不易均匀分散，降低酶解效果。由极值分析得出影响酶解谷朊粉产物DH的因素主次顺序为酶解温度＞底物浓度＞酶解时间＞加酶量＞pH，按各因素水平应选择A4B3C2D3E4作为最佳酶解组合，即酶解时间4 h、酶解温度55 ℃、加酶量3%、底物浓度10%、酶解pH 8.5。

图6 酶解pH对酶解谷朊粉的影响

表2 正交试验结果

2.3.2 验证试验

在酶解时间4 h、酶解温度55 ℃、加酶量3%、底物浓度10%、酶解pH 8.5的酶解条件下，测得酶解液中水溶性蛋白质含量为43.98%、DH为18.36%，比优化前水溶性蛋白提高了48.13%，DH提高了14.41%。

3 讨论

以谷朊粉为底物，通过典型水解试验考察了六种常用蛋白酶水解效果，试验结果显示：N（碱性蛋白酶）和D（中性蛋白酶）两种酶水解谷朊粉效果较其他四种酶好，能够显著提高谷朊粉的水溶性，但N的水解效果略高于D，因此，后续试验选择N作为酶解改性谷朊粉的蛋白酶。蛋白酶都有适宜的酶解温度，试验结果显示在55～60 ℃下，水溶性蛋白质含量和DH在55 ℃时分别达到47.28%和25.84%，表明酶解谷朊粉在55 ℃时具有较好的水溶性。通过底物浓度与酶解效果的影响试验，发现中低浓度的底物浓度更有利于水溶性蛋白质含量和DH的生成，即有利于谷朊粉水溶性的提高，当底物浓度为10%时，碱性蛋白酶水解谷朊粉酶解底物中水溶性蛋白质和DH含量最高，分别为38.18%和22.18%。

谷朊粉酶解和酶的添加量也有较大的关系，试验证明显示加酶量为4%时水溶性蛋白质含量和DH分别为40.12%和22.13%，谷朊粉水溶性提高较多。当加入的酶较少时，则底物中谷朊粉含量较多，即较少的酶无法充分利用底物中的谷朊粉，谷朊粉利用率低，导致水溶性蛋白质含量和DH较低；过高的酶可以利用底物中全部的谷朊粉，但会导致成本上升，不利于实际生产。酶解时间在3.5 h时，水溶性蛋白质含量为48.13%，DH为27.14%，使谷朊粉具有较好的水溶性。试验结果显示，当pH 8.5时，水溶蛋白质含量和DH达到最高。酶解pH过低或过高都不利于酶活性的表达，造成酶解反应水解度的降低。

4 结论

通过典型水解试验从常见六种蛋白酶中筛选出水解谷朊粉的最佳蛋白酶，为碱性蛋白酶。水解试验显示碱性蛋白酶水解谷朊粉水溶性蛋白质含量和DH分别为43.98%和18.36%，使酶解后谷朊粉具有较好的溶解性。

单因素试验结果显示：最佳酶解温度为55 ℃，最佳底物浓度为10%，最佳加酶量为3%～4%，最佳酶解时间为3～4 h，最佳酶解pH为7.5～8.5。通过正交试验得出最优因素主次顺序为酶解温度＞底物浓度＞酶解时间＞加酶量＞pH，且A4B3C2D3E4为最佳酶解组合，即酶解时间4 h、酶解温度55 ℃、加酶量3%、底物浓度10%、酶解pH 8.5。