银杏叶提取物中总黄酮含量的荧光光度法测定

2020-01-13黄肖桢杨金鑫刘伶文王晓军

西安工程大学学报 2019年6期

黄肖桢，刘斌，常薇，杨金鑫，刘伶文，王晓军

(西安工程大学环境与化学工程学院,陕西西安 710048)

0 引言

银杏(Ginkgo biloba L.)又名白果、公孙树,为我国特产植物[1]。银杏叶是银杏重要的医药部位,其中主要成分为黄酮类和内酯类化合物[2-5]。银杏叶黄酮主要是以黄酮糖苷的形式存在, 由山奈酚、槲皮素以及异鼠李素等黄酮苷元与葡萄糖等单糖以O-糖苷键联接而成, 以该种形式存在的黄酮占到提取物黄酮总含量的95%以上[6]。银杏黄酮具有抗衰老、抗菌、消炎等功效[7-9]。

银杏叶提取物(GBE)的有效成分主要是黄酮苷类和萜类物质[10-11],药理活性广泛且不良反应较少[12]。测定黄酮常采用紫外分光光度法(UV)、响应面法和高效液相色谱法(HPLC)[13-15],国外也有报道采用HPLC法[16-17]。UV法操作简单、方便,所需成本较低,故普遍用来测定植物中总黄酮的含量[18]。本文依据黄酮类化合物可以与Al3+形成一种稳定的荧光络合物[19](5-羟基黄酮铝络合物),提出用荧光光度法[20]测定总黄酮含量。实验结果表明，所采用的方法操作简便,检测高效快速,结果准确,数据重现性良好,适合用于银杏叶提取物中总黄酮含量的测定。

1 实验

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂芦丁标准品(C27H30O16,上海源叶生物科技有限公司);无水乙醇(分析纯,天津天力化学试剂有限公司);六水合氯化铝(分析纯,天津天力化学试剂有限公司);冰醋酸(分析纯,天津富宇精细化工有限公司);氢氧化钠(分析纯,天津福晨化学试剂厂);正丁醇(分析纯,天津天力化学试剂有限公司)。

1.1.2 仪器 RF-5301型荧光分光光度计(日本岛津),移液枪(YE3K158723,大龙兴创实验仪器有限公司),超纯水机(UPD-I-10T,四川优普超纯科技有限公司),烧杯、量筒、容量瓶。

1.2 实验过程

准确移取样品溶液1 mL,置于25 mL容量瓶中,加入正丁醇溶液5 mL,pH=4的醋酸-醋酸钠缓冲溶液2.5 mL,质量分数为10%的氯化铝溶液7.5 mL,用60%的乙醇定容至刻度，摇匀。在激发波长为442 nm,发射波长为482 nm的条件下,测定荧光强度,再用回归方程求取含量。

2 结果与讨论

2.1 5-羟基黄酮铝络合物的激发及发射光谱

芦丁与Al3+发生络合反应生成的5-羟基黄酮铝络合物具有较强的荧光,其荧光光谱如图1所示。图1中F表示荧光强度(cd),λ代表激光波长(nm)。由图1可知,它的最佳激发波长为λex=442 nm,最佳发射波长为λem=482 nm。

图1 5-羟基黄酮铝络合物的激发及发射光谱

2.2 测定条件

2.2.1 乙醇质量分数对荧光强度的影响在芦丁质量浓度为12 mg/L,氯化铝质量分数为10%,醋酸-醋酸钠pH=4,正丁醇含量为5 mL的条件下,测试不同乙醇浓度对溶液荧光强度的影响,结果如图2所示。

图2 乙醇质量分数对荧光强度的影响

从图2可知,溶液的荧光强度随乙醇浓度增大而显著增强。这是由于给电子取代基团—OH会与芳香环形成p-π共轭,增强了π电子共轭程度,使得荧光强度增强。选用质量分数为60%的乙醇溶液用作溶剂,这样可降低成本并且具有较好的测定效果。

2.2.2 正丁醇含量对荧光强度的影响在芦丁质量浓度为12 mg/L,氯化铝质量分数为10%,乙醇质量分数为60%,醋酸-醋酸钠pH=4的条件下,测试不同正丁醇的含量对荧光强度的影响,结果如图3所示。

图3 正丁醇含量对荧光强度的影响

从图3可知,随着正丁醇含量的增加,溶液的荧光强度先逐渐增强,随后减弱,在加入量为5 mL的时候达到最大值。这是由于给电子基团—OH增强了π电子共轭程度,使得荧光强度增强；之后由于正丁醇在溶液中所占体积比增大,产生荧光淬灭,使得荧光强度减弱。所以,本实验选用加入正丁醇的含量为5 mL。

2.2.3 pH值对荧光强度的影响在芦丁质量浓度为12 mg/L,氯化铝质量分数为10%,乙醇质量分数为60%,正丁醇含量为5 mL的条件下,测试不同pH值对溶液荧光强度的影响,结果如图4所示。

图4 pH值对荧光强度的影响

从图4可知,当pH=4的时候,所测得的荧光强度最大；pH=6时,最大发射波长已发生了偏移,可能是黄酮类化合物在偏中性环境与铝离子生成了另一种络合物。所以,本次实验选用了pH=4的醋酸-醋酸钠缓冲溶液。

2.2.4 氯化铝质量分数对荧光强度的影响在芦丁质量浓度为12 mg/L,乙醇质量分数为60%,醋酸-醋酸钠pH=4,正丁醇含量为5 mL的条件下,测试不同氯化铝质量浓度对溶液荧光强度的影响,结果如图5所示。

图5 AlCl3质量分数对荧光强度的影响

从图5可知,随着氯化铝的质量浓度增加,溶液的荧光强度先逐渐增强,随后减弱；在氯化铝的质量分数为10%时,荧光强度达到最大。原因是黄酮类化合物与铝离子形成的荧光络合物浓度较高时,荧光分子间碰撞几率增加,分子间相互作用形成二聚体,产生荧光淬灭现象,使得荧光强度减弱。所以,本次实验选用质量分数为10%的氯化铝溶液。

2.2.5 静置时间对荧光强度的影响在芦丁质量浓度为12 mg/L,氯化铝质量分数为10%,乙醇质量分数为60%,醋酸-醋酸钠pH=4,正丁醇含量为5 mL的条件下,配得溶液。将溶液在室内(无阳光直射)静置,并在不同的静置时间下测定其荧光强度,结果如图6所示。