转录组中LncRNA在牛上的研究进展

龚龑，刘士钊，马海明

（1.湖南农业大学动物科学技术学院，长沙 410128；2.湖南普菲克生物科技有限公司，长沙 414000）

自20世纪70年代以来，蛋白质编码基因的转录一直是分子遗传学研究的重点。很多物种的基因组在转录过程中均产生数量巨大的非编码RNA（ncRNA0），早期其被认为是在转录过程中产生的“垃圾”和翻译过程中的“噪声”，但伴随越来越多的ncRNA被鉴定，逐渐证明其在机体发育和病理等过程中均有调控作用。第一个长链非编码RNA（LncRNA）于1990年被发现，其转录物缺少长的开放阅读框，表明RNA本身是功能性的，而不是编码的蛋白质产物[1]。同样，对X染色体失活至关重要的Xist也在1991年被发现，并证明其也缺乏编码蛋白能力[2]。2002年，日本科学家在对小鼠的全长cDNA进行人工注释时，确定了大部分不能编码蛋白的核酸序列为长链非编码RNA，由此拉开了长链非编码RNA的研究序幕[3]。如今在基因组测序技术飞速发展的带动下，整个转录组学的研究进展也得到了快速发展，而利用二代和三代高通量测序技术，使得大量的lncRNA被发现和鉴定。

1 LncRNA分类及其生物学功能

长链非编码RNA的长度大于200个核苷酸，大部分的lncRNA具有3’-poly-A尾和 5'-7甲基鸟苷帽，其结构与mRNA相似，均由RNA聚合酶II合成[4]。Lnc RNA可以折叠成多种二级结构，从而促进其与DNA、RNA和蛋白质的相互作用。根据基因组的位置可以将lncRNA分为基因间lncRNA、内含子lncRNA和反义lncRNA。其中，基因间长链非编码RNA位于编码或非编码基因之间；内含子长链非编码RNA位于蛋白编码基因的内含子中；反义长链非编码RNA则是从编码基因的相反链转录而来，其转录起始位点位于宿主基因的下游，转录本通常与相应mRNA序列有重叠[5]。大多数的lncRNA（＞60%）是上游反义RNA，位于活性蛋白编码基因的转录起始位点附近，可能从启动子中产生不同转录的IncRNA/mRNA基因对。还有相当一部分的lncRNA（大约20%）位于增强子区域。余下的lncRNA（大约5%）来自于与注释基因重叠的正义和反义转录本，或者（大约5%）来自于未注释的区域，这些lncRNA有时也被称为基因间lncRNA[6]。

LncRNA在细胞增殖及细胞周期、代谢、凋亡、分化和维持等多个过程中发挥着生物学功能：①通过作为分子支架参与染色质修饰和机构重塑；②增强子衍生的lncRNA通过使染色体成环控制增强子与同源启动子之间的联系；③可以与剪接因子（SFs）和诸如SR或hnRNP蛋白这一类剪接调节剂相互作用，进而调节RNA的可变剪接；④含有与miRNA序列互补的位点，从而隔离它们并阻止其与mRNA结合，起到拮抗miRNA的作用，其方式类似海绵，也因此成为“海绵效应”；⑤反义lncRNA可以对相对应的正义转录本的转录有促进或抑制作用；⑥直接对mRNA的衰减有调控作用[7]。

2 LncRNA在牛上的研究进展

长链非编码RNA通过对基因印记、染色质重塑、剪接调控、细胞分化调控、mRNA降解和翻译的调控来发挥其生物学功能。它们从转录噪声到成为新的基因表达调控因子，在基因调控的各个方面，包括表观遗传调控、X染色体失活、基因组印迹、核和细胞质贩运、转录和mRNA剪接等都发挥了调控作用。尤其近年来，lncRNA的研究成为热点，但主要集中在对人和小鼠的神经性疾病、肿瘤、胚胎发育、细胞分化等的影响方面，而在家畜上的研究则相对滞后。目前，IncRNA在家畜上的研究主要集中在细胞分化、脂肪合成、胚胎及肌肉发育的调控方面。尽管IncRNA缺乏编码能力，但许多lncRNA在各种生物过程中都发挥着功能作用，这为基因组复杂的结构组织和功能增加了一个新的调控网络。

2.1 与肌肉发育相关的lncRNA研究

牛肉为人类提供了优质的动物蛋白，肌肉的发育是肉牛养殖的重要经济性状。Liu等通过对海福特肉牛的背部、肩胛部、肋间和臀部的肌肉组织进行RNA测序，鉴定和筛选了7 188条lncRNA序列，发现这些lncRNAs在开放阅读框和表达水平上与其他哺乳动物lncRNAs有相似特征。确定了IncRNA的染色体位置和全局表达模式，还检测到36个Inc RNAs、62个miRNAs和12个mRNA之间与肌肉发育相关的Inc RNA-miRNA-mRNA的重要相互作用关系，提供了牛骨骼肌特有的IncRNA的表达模式[8]。随后，Yue等又在这四个部位的肌肉组织中鉴定出高表达量的lncRNA-YYW。在成肌细胞分化过程中，IncRNA-yyw的表达逐渐增加，其过表达增加了细胞周期中DNA合成阶段的细胞数目，上调了肌原性标记物肌生成素和肌球蛋白重链的表达。通过微阵列分析表明lncRNA-yyw正向调节生长激素1及其下游基因akt1和pik3cd在牛成肌细胞中的表达。LncRNA-yyw还通过过表达证实了可以促进GH1的表达，进一步上调了其下游基因，促进了成肌细胞的增殖[9]。Choi等通过对韩牛的骨骼肌和脂肪组织研究，根据表达水平的差异，识别了12个与剪切力相关和6个与体重相关的lnRNAs，这是在韩牛种群育种策略中两个重要的性状。同时，还识别出在牛转录物中的11个lncRNAs，其中4个与肌肉功能相关[10]。利用配对末端RNA测序，检测利木赞肉牛胸最长肌，发现一些在肌肉中表达的lncRNA位于肉质性状的数量性状位点内，说明在调节牛肉品质方面lncRNA可能存在功能作用[11]。

2.2 与泌乳相关的lncRNA研究

在不同的日粮添加过程中，可以改变奶牛的产奶量和乳品质。在日粮的变化中，lncRNA的调节功能也发生了变化，这是受到了日粮变化的影响。在奶牛精料中分别添加5%的亚麻籽油和红花油进行饲喂试验，然后活体取乳腺组织样，进行RNA测序。结果在总共鉴定的4 955个lncRNAs（325个已知的和4 630个新的）中，亚麻籽油组和红花油组中潜在的顺式靶基因分别为59个和494个。lncRNA的顺式靶基因的富集分析表明，其在免疫功能、核酸代谢和细胞膜结构、Notch、cAMP和TGF-β信号通路中起到了重要的作用。两个处理组分别鉴定了32个和21个差异表达的lncRNA，其中有6个潜在的顺式lncRNA基因（KCNF1、STARD13、BCL6、NxPE2、HHIPL2和MMD）在不同日粮中，对乳腺功能发挥了调控作用[12]。lncRNA对产奶的调控，还受到了外界环境的影响。当处于热应激中，奶牛整个机体都会产生反应，最终体现在采食量和泌乳量的下降。以往对哺乳动物热应激分子机制的研究主要集中在蛋白质编码基因和短链非编码RNA的调控作用上。现在通过RNA测序技术研究了热应激状态下奶牛的lncRNA表达谱，发现在奶牛乳腺中3 763个已知和24 795个新的lncRNAs，其中上调的有156个，下调的有18个。通过顺式作用分析有16 474个lncRNAs在编码蛋白基因附近。这也说明了在热应激状态下lncRNA对乳腺功能发挥了调控功能[13]。

成母牛的生产周期，主要分为泌乳期和干奶期，通过对lncRNA的研究也发现了不同的生产阶段存在着转录差异。Yang等从干奶期和泌乳期荷斯坦牛的乳腺组织中鉴定出差异表达的3 746个lncRNAs和2 890个基因。靶基因的功能富集分析表明，这些lncRNAs参与了与哺乳相关的信号途径，包括细胞周期、JAK-STAT、细胞黏附和PI3K-Akt信号通路。同时还发现与哺乳相关的miR-221可能与lncRNA TCONS_00040268、TCONS_00137654、TCONS_00071659和TCONS_00000352相互作用，说明这些lncRNAs可能在哺乳周期发挥了重要的调节功能[14]。而在奶牛泌乳高峰期和泌乳末期，通过对奶牛乳腺组织采样研究分析，发现在鉴定的1 000个lncRNAs中，有117个在泌乳高峰期和泌乳末期呈差异表达。牛lncRNA较短，外显子数较少，表达水平明显低于蛋白质编码基因。差异表达的lncRNAs中有72个与340个蛋白编码基因共表达，主要是与脂质代谢和葡萄糖代谢有关，包括过氧化物酶体增殖物激活受体和5’腺苷激活的蛋白激酶信号通路。进一步分析发现有12个lncRNAs与泌乳性能相关，并发挥了重要作用[15]。

Zeng等对牛奶中的外泌体用RNA测序技术研究，首次发现牛奶中含有lncRNA，经鉴定3 475个新的和6个注释的lncRNAs，发现了外泌体中的lncRNA与其他哺乳动物的长度、外显子数和开放阅读框的共有特征，然而不同的是其表达量却高于mRNA。选择其中高表达的12个lncRNAs进行GO和KEGG分析，表明这些lncRNAs有调节免疫功能及成骨细胞生成、神经发育、生殖、细胞增殖和细胞-细胞通信的功能。这些高表达的lncRNAs在牛奶外泌体中的表达水平在不同的泌乳阶段表现出不同的变化，说明在泌乳不同阶段发挥了不同的功能[16]。

2.3 与胚胎发育和细胞分化相关的lncRNA研究

在牛的卵母细胞和早期胚胎中发现的大量的Inc RNA分子中，选择了在细胞质中的3个候选基因，发现与多核糖体相关，其中一个基因与卵丘细胞和卵母细胞相关。在成熟卵母细胞中敲除相关转录本会提高发育率，使得囊胚更大。通过对这些囊胚的转录组和甲基化分析，发现有的基因对囊胚的存活很重要，说明lncRNA对于卵母细胞的发育有调控作用[17]。

通过分析胎儿期和成年期牛骨骼肌组织中Inc RNA的表达，发现了13 580个IncRNAs候选基因。其中许多lncRNAs在两个发育阶段有表达差异。在所有下调的IncRNAs中表达水平最高的IncRNA-MDNCR，可以与miR-32结合，GosB是miR-32的靶基因，可以促进牛原代成肌细胞的分化。MDNCR的过表达可以消除miR-32的作用进而增加GosB的表达量，说明MDNCR通过海绵作用miR-133a促进成肌细胞分化，抑制细胞增殖[18]。而lncRNA-FAM200B在胚胎、新生犊牛和成年牛的骨骼肌中均有不同程度的表达。牛骨骼肌中的FAM200B含有2个外显子共472个核苷酸，在启动子区富含sp1转录因子，可以促进肌源性调节因子MYoD和DNA序列的结合。在成肌细胞增殖和分化阶段，FAM200B的表达趋势与MYoG和MYf5的表达趋势呈正相关，表明FAM200B是肌肉发育的正调控因子[19]。在Sun等同样的研究中发现了401个lncRNAs在三个发育阶段之间的差异表达。其中IncMD在成肌细胞分化过程中逐渐上调。而lncMD沉默则降低了两个成熟的肌源性标记——肌球蛋白重链(MHC)和肌原蛋白(Myog)的表达。LncMD是miR-125b的分子海绵，胰岛素样生长因子2(IGF2)是miR-125b在牛中的直接靶点。IncMD水平与牛肌肉组织IGF2 mRNA水平呈正相关[20]。

LncRNA还参与了组织脂肪发生，脂肪酸、胆固醇和磷脂代谢和转运，以及高密度和低密度脂蛋白（HDLs和LDLs）的形成。LncRNA还针对一些在调节脂质代谢中起重要作用的转录因子，如过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)[21]。与脂肪细胞分化相关的ADNCR是一种新发现的lncRNA。它通过靶向mir-204发挥作用，在mRNA和蛋白质水平上显著调节靶SIRT1基因在前脂肪细胞中的表达，从而抑制脂肪的发生[22]。LncRNA-ADNCR通过作为竞争性内源性RNA(ceRNA)对miR-204起作用而抑制脂肪细胞的分化，由于ADNCR在牛前脂细胞中表达量的下调从而增强miR-204靶基因SIRT 1的表达。SIRT 1通过与NCoR与SMART对接而抑制PPARγ活性[23]。

雄性种系干细胞（mGSCS）的自我更新和分化为持续精子发生提供了基本功能。GDNF、bFGF、csf 1、EGF等生长因子能维持MGSCS的自我更新。IGF-1可激活AKT和ERK信号通路的磷酸化，在调节牛MGSCS的增殖和凋亡中起重要作用。在IGF-1受体（IGF-1R）被IGF-1R特异性抑制剂阻断后，MGSCS的增殖率降低，而凋亡率增加。LncRNA H19通过IGF-1信号通路参与MGSCS的增殖和凋亡调控，当H19被干扰时，生精小管中的细胞数减少[24]。

2.4 与疾病相关的lncRNA研究

乳房炎是奶牛养殖业中造成经济损失最大的常见疾病。LncRNA在人类乳腺发育及乳腺疾病上有广泛深入的研究，但是在奶牛乳房炎上的研究却较少。Tong等通过CPAT、CNCI、CPC和hmmscan分析软件在886个未知基因间的转录本中，鉴定了184个lncRNAs，与2016年的非编码数据库和家畜长链非编码数据库（ALDB）进行比对，在牛乳腺中发现了112个新的lncRNAs。研究发现36个lncRNAs位于172个乳相关QTLs中，重要的是在临床乳腺炎QTL区发现有1个lncRNA，说明lncRNA对奶牛乳房炎可能存在调控作用[25]。Ma等通过建立两种炎症性牛乳腺腺泡细胞（mac-t）模型，然后感染大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，发现奶牛乳房组织和炎症细胞中linc-Xist的表达异常增加，Xist沉默可显著增加大肠杆菌或金黄色葡萄球菌诱导的促炎细胞因子的表达。此外，Xist基因敲除还能抑制细胞增殖，抑制细胞活力，促进细胞在炎症条件下的凋亡；Xist可抑制大肠杆菌或金黄色葡萄球菌诱导的NF-Kb磷酸化和NLRP3炎症小体的产生。NF-KB途径的激活可以促进Xist的表达，Xist的表达还可以负反馈调节NF-KB炎症途径[26]。

犊牛病毒性腹泻（BVDV）可以导致犊牛出现高热和腹泻，死亡率较高，对犊牛危害极大，同时还可以导致母牛出现流产。Ma等通过牛肾细胞（MDBK）感染BVDV病毒，然后进行测序分析。在感染后的3个阶段共有1 236个IncRNA转录本和3 261个mRNA转录本进行了差异调节。在感染过程中，发现lncRNA参与了免疫反应调节[27]。

通过对印度瘤牛角质磷状癌细胞中的差异表达与肿瘤相关编码基因的分析，发现了有59个差异显著的表达基因和19个lncRNAs。使用相关分析鉴别了共表达的mRNA-LNCaNAs，确定了联合表达的mRNAIcRNAs与其在角癌中的调控作用之间的关系。证实7个上调lncRNA（XLOC_000016、XLOC_002198、XLOC_002851、XLOC_007383、XLOC_010701、XLOC_010272和XLOC_011517）和一个下调lncRNA（XLOC_011302）与11个角蛋白家族蛋白、角蛋白相关蛋白家族、角质蛋白、丝氨酸家族蛋白和金属硫蛋白相关的基因之间有正相关联系，并通过细胞生长、细胞侵袭和细胞迁移等方式在鳞状细胞癌中发挥调节作用[28]。

3 小结与展望

目前，尽管lncRNA在家畜上的研究还处于起步阶段，但是近年来相关研究开展迅速，尤其在肉牛、奶牛等反刍动物的生产性能、繁殖、细胞分化、疾病、育种等方面进行了大量的研究。但是，对于lncRNA的研究深度远远不如mRNA和micRNA，lncRNA的物种数据库相关的数据还是不够，今后应该列为重要研究内容。