乳中硫氰酸钠检测方法研究进展

张宁，周鑫，张养东，董李学，杜瑞焕，戚继存，郑百芹

（1.河北省唐山市食品药品综合检验检测中心，唐山 063000；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农业部奶产品质量安全风险评估实验室(北京)，北京 100193；3.河北省农产品质量安全检测技术创新中心，唐山 063000；4.河北省唐山市滦南县农业农村局，唐山 063500）

乳是新生儿和新生动物的基础食物，可提供各种蛋白质、碳水化合物、矿物质和维生素。乳也可为各个年龄段的人带来丰富的营养，被用来制作成各种保健食品[1]。但生鲜乳极易变质腐败，保藏期非常短。据不完全统计，在牛乳收购、运输、贮藏的过程中，由于生乳酸败变质而不能用于加工生产的原料乳损失达5%，造成了原料乳的大量浪费，增加了乳品加工生产与运营成本[2]。

乳过氧化物酶体系（LPS）存在于鲜牛乳中，是一种由乳过氧化物酶（LP）、过氧化氢、硫氰酸钠三种物质组成的一种天然抗菌体系，在硫氰酸钠和过氧化氢的存在下，经LP催化，硫氰酸钠被过氧化氢氧化，生成一种中间产物——亚硫氰酸盐（OSNC-），亚硫氰酸盐能特异性与游离于细菌表面的巯基结合，使与细菌代谢活动相关酶失去活性，抑制细菌的繁殖，由此起到抑菌保鲜效果[3,4]。为利用乳过氧化物酶体系对生鲜乳进行抑菌保鲜，人们开始在牛奶中加入硫氰酸钠和过氧化氢[5]。

然而，随着研究的不断深入，硫氰酸钠的毒性也日益显现。研究表明，少量摄取硫氰酸钠可阻碍机体对碘的吸收利用，引起甲状腺疾病[6]。过量的硫氰酸钠会对人体健康造成危害，引发急性毒性作用，引起以消化系统和神经系统功能紊乱以及皮肤损害为主的全身性疾病[7]。因此，2018年，卫生部公布的《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》中明令禁止在生乳中添加硫氰酸钠。然而，研究表明，生乳中天然存在少量的硫氰酸钠，且饲喂十字花科类植物可使生鲜牛乳中的硫氰酸钠含量上升[8,9]，说明亟需建立迅速、准确、灵敏的方法来检测乳中的硫氰酸钠。目前，硫氰酸钠的检测方法主要包括分光光度法、气相色谱法、离子色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、表面增强拉曼光谱法等。本文主要对以上各种方法在检测乳中硫氰酸钠的研究进展进行综述，并对今后的研究方向进行展望。

1 分光光度法

硫氰酸钠可与铁盐作用生成血红色的硫氰化铁，因此可利用分光光度计建立硫酸氢钠与吸光度之间的关系[10,11]。水明等利用可见分光光度法测定牛乳中硫氰酸钠的含量，发现在浓度为2.5～20μg/mL，波长为457nm下，吸光度与硫氰酸钠质量浓度线性关系良好，线性回归方程为:A=4.15×10-2C+9.5×10-3，相关系数R2=0.9991，测得回收率为96.0%～104.0%，相对标准偏差（RSD）为0.58%～1.16%[12]。为研究该方法的日间变异系数，伍金娥等采用紫外分光光度法测定掺假牛奶中的硫氰酸钠的含量，结果显示日间变异系数均在4.85%以下[13]。为拓展该方法的应用范围，王静选择牛奶和奶粉作为样品进行研究，发现硫氰酸钠浓度为1～30mg/L、460nm波长时，吸光度呈良好线性关系，奶粉和牛奶的相对标准偏差分别为3.47%和2.23%，加标回收率为98.6%～99.7%。标准溶液显色后，在30min内进行检测，相对稳定[14]。然而，该方法存在灵敏度偏低、显色稳定性相对不高[15]，通量不高、涉及有毒的三氯乙酸和劳动强度偏大等问题，不适宜检测硫氰酸钠含量较低的牛奶样品。

2 气相色谱法

气相色谱法是一种分析速度快和分离效率高的分离分析方法。近年来采用高灵敏选择性检测器，使得它又具有分析灵敏度高、应用范围广等优点。胡桂林等人建立了一种用气相色谱法测定牛奶和奶粉中硫氰酸盐质量分数的方法。该方法回收率为91.1%～106.2%，相对标准偏差小于3%，最低检出限为0.1mg/kg，且检测结果准确可靠，重复性好，灵敏度高，可进行牛奶和奶粉中硫氰酸盐的检测[16]。2014年国家质量监督检验检疫总局颁发的进出口行业标准《SN/T 3927-2014 出口乳制品中硫氰酸钠含量的测定》也将其用作测定乳制品中硫氰酸钠含量的方法之一。然而，该方法需要使用有毒试剂氯胺-T进行衍生，因此在国内的检测和科学研究中应用相对不多，相关报道较少。

3 离子色谱法

离子色谱法是目前检测乳中硫氰酸钠应用最广泛的方法[17～20]。其原理是用乙酸溶液沉淀蛋白后过滤，上清液再用氢氧化钾溶液沉淀蛋白。过滤后，直接将试样注入离子色谱仪分离，外标法定量[21]。李滢倩运用离子色谱法对牛乳中硫氰酸盐含量进行测定，发现回收率为88.0%～106.4%，相对标准偏差为0.40%，检出限和定量限为0.08μg/mL和0.26μg/mL，线性范围为0.5～10μg/mL，相关系数为0.9995[22]。为提高检测通量，冯伟科等人用离子色谱同时测定奶及奶制品中亚硝酸盐、硝酸盐、硫酸盐和硫氰酸盐的含量，发现该方法的线性范围和相关系数为0.02～5.0μg/mL和0.9992，检出限为0.005～0.02mg/kg；相对标准偏差为0.87%～2.6%，加标回收率为87.8%～100.4%[23]。为进一步优化离子色谱法的各项参数，李锦等建立了离子色谱法测定牛乳中硫氰酸盐含量的不确定度评估方法，发现标准系列溶液的配制过程对扩展不确定度的影响较大，是不确定度的主要影响因素[24]。为探寻低毒、安全的前处理试剂以及性价比高的固相萃取小柱，黄惠雯以生鲜牛奶为原料，在《MRT/B 8-2016生乳中硫氰酸根的测定离子色谱法》基础上优化前处理方法。结果表明，采用乙醇作为蛋白质沉淀剂及HLB固相萃取小柱作为生鲜牛奶中测定硫氰酸钠的前处理方法，具有操作简单、性价比高、试剂安全低毒等优点[25]。然而，离子色谱法存在线性范围不宽的问题，线性范围一般为0.1～2mg/L[26,27]，线性宽度仅跨越一个数量级，限制了其应用的简便性和灵活性。

4 高效液相色谱法

高效液相色谱法一直是各种物质检测的重要手段之一，近年来在乳中硫氰酸钠的检测中得到广泛应用[22,28～31]。李滢倩运用高效液相色谱法对牛乳中硫氰酸盐含量进行测定，回收率为84.0%～89.1%，相对标准偏差为1.20%，仪器的最低检测限为0.06mg/L，线性范围为0.2～20μg/mL，相关系数达到0.9998[22]。吴剑平等人对检测方法进行系统评估，发现浓度范围在5～500mg/L内线性较好，R2＞0.9995，适用于生鲜乳和巴氏杀菌成品乳，检测限可达到0.2mg/kg，定量范围0.5～50mg/kg，精确度＜10%，回收率＞90%[28]。为进一步降低检出限，研究者以十六烷基三甲基溴化铵和柠檬酸为流动相，用二极管阵列检测器检测，检测波长218nm，该方法线性范围为0.2～100μg/mL，回收率为95%以上[32,33]。随后的研究主要集中在样品前处理的优化和检测速度的提升上。杨瑾建立了牛奶中硫氰酸钠的QuEChERS-HPLC快速检测方法。该方法操作简便、快速灵敏，适用于牛奶中硫氰酸钠的快速检测和日常监控。然而，高效液相色谱法存在通量不高、涉及有毒有害试剂、成本较高等问题。

5 毛细管电泳法

毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）又称高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE），是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术[34,35]。吴剑平等人运用毛细管区带电泳法直接检测牛奶中硫氰酸钠质量浓度，结果表明以二极管阵列紫外检测器218nm波长下分析样品，质量浓度范围在5～500mg/L内线性较好，R2＞0.9995。该方法可适用于生鲜乳和巴氏杀菌成品乳，检测限可达到0.2mg/kg，定量范围0.5～50mg/kg，精确度＜10%，回收率＞90%[36]。然而，毛细管电泳的重现性有待提高，且未经系统培训的工作者难以掌握，因此在国内的检测和科学研究中应用较少。

6 表面增强拉曼光谱法

表面增强拉曼散射光谱法是在粗糙的贵金属表面引起拉曼信号增强现象的基础上发展起来的一种方法，具有检测实时快速、灵敏度高、分子识别性专一等优点，适合检测微量的小分子，近年来也有研究人员将其用于检测乳中的硫氰酸钠[37～40]。周宇利用表面增强拉曼光谱对硫氰酸钠牛奶溶液进行了光谱特性的分析。分析结果表明牛奶对硫氰酸钠的定性分析没有影响，但是由于牛奶中大分子成分的影响导致光谱图中信噪比有所降低[37]。林翔等人使用表面增强拉曼光谱(SERS)结合聚集的银溶胶活性基底检测牛奶中硫氰酸钠的残留，得到最低检测限为10ppb，增强因子约为5.4×106。用三氯乙酸沉淀牛奶样品中的蛋白成分，同时存留在待测液中的三氯乙酸促使银溶胶凝聚进而提高其增强效率，得到的最低检测限在0.1～10ppm范围内[38]。为进一步拓展该方法的应用范围，林翔针对三种不同的食品基质，建立了一种简单快速的牛奶中硫氰酸钠的SERS检测方法，仅需10min便可完成检测，检测限可达1.45ppm[40]。然而，由于该方法所需的仪器比较昂贵，且需要操作者具有较高的理论基础和知识储备，因此，该方法目前仅用于实验室研究，未得到广泛推广和应用。

7 展望

随着科学技术日新月异，科研工作将越来越精细，越来越深入。人们早期将硫氰酸钠用作牛奶保鲜剂，到如今明令禁止使用，正是科学不断进步的结果。新的发现催生新的问题，如内源性硫氰酸钠的发现，要求在检测和研究乳中硫氰酸钠时，其检测方法具有更低检出限。目前，虽然可用的方法很多，如分光光度法、气相色谱法、离子色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法和表面增强拉曼光谱法等，但这些方法普遍存在灵敏度不高、稳定性重现性较差、通量不高、劳动强度偏大、成本较高、操作复杂等缺点。目前，质谱技术、人工智能和自动机械化设备已经较为成熟，相信随着更多科学技术的突破发展和学科之间的相互融合，更加快速、灵敏、准确、高通量、自动化、成本低、操作简便的检测技术将会不断涌现。