人源性肝癌组织移植模型研究进展

刘世芳，李宜航，陈德力，苏 晶，吕亚娜，丁 璇，李 光，孙晓波

(1. 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所云南分所药理中心，云南 景洪 666100；2. 西双版纳州傣药南药重点实验室，云南 景洪 666100；3. 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所海南分所植物化学中心，海南 海口 570311；4. 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所药理毒理中心，北京 100093)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是危害极大的恶性肿瘤，研究者为能深入研究肝癌的发病机制及筛选药物活性，建立多种肝癌动物模型。常见的肝癌动物模型包括化学试剂诱导肝细胞癌动物模型、肝癌细胞或肝癌组织移植模型以及遗传修饰肝细胞癌模型等[1]，但目前这些造模方法均存在一定的局限性。化学试剂诱导肝细胞癌动物模型是通过致癌物诱导形成，但在致癌物、试验动物等方面的选择有很大缺陷，且诱导时间长，动物死亡率高，肿瘤发生时间、位置、病灶数等差异较大；遗传修饰肝细胞癌动物模型，通常会出现基因组不稳定，其形成的肝癌始终是鼠源性，与人自身肝癌的形成终有一定差异，对研究肝癌的发生发展机制、药物的筛选以及新的治疗方法研发等有很大的制约性。

PDX模型在肿瘤药物筛选以及实现个体化治疗方面更具有优势[2]，肝癌PDX模型也在不断的开发利用。肝癌PDX模型是将肝癌患者的肝癌组织移植到免疫缺陷小鼠皮下或者经皮下传代后移植到肝内而构建的肝癌动物模型[3]。该模型能很好保持原代肿瘤的组织病理学、生长及转移特性，并在多次传代后仍然能够较大程度保留原代肿瘤的特性，与原始患者肿瘤密切相关，具有重要的科研价值。

1 肝癌PDX模型建立及组织冻存与复苏

肝癌PDX模型建立方法主要有两种方法：①皮下移植：获取新鲜的肝癌组织切成小块组织或研磨为匀浆，与基质胶充分混合，再将选好的组织用套管针将肿瘤块穿刺至免疫缺陷品系小鼠皮下，或者吸取匀浆组织注射到皮下，并用灭菌棉签按压进针部位，避免出血及组织溢出。②皮下-肝内移植：在皮下移植的基础上进行一定次数的传代，按照皮下移植的方法将癌组织处理，对免疫缺陷鼠进行麻醉，打开小鼠腹腔，暴露出肝脏。在肝脏外叶刺出小的隧道，把制备好的瘤块置入隧道或者吸取匀浆组织注入肝脏，或用可吸收缝合线将癌组织直接与肝脏进行缝合，轻压止血。为保证后期实验，通常将获得的癌组织进行冻存，在后期需要实验时再复苏，且全程在无菌操作台中进行，以保证组织的无菌性。

组织冻存方法：用无菌眼科剪将坏死的肿瘤组织、脂肪组织、纤维组织剔除，尽可能保存具有活性的组织。将组织剪成50～100 mm3小块，用含有青霉素、链霉素的缓冲液反复冲洗3次，把组织块上血迹清洗干净。肝癌组织瘤块放入含有10% DMSO和90% FBS的冻存管中，将冻存管放入冻存盒在4 ℃放置1 h，转入-20 ℃ 2 h，再转入-80 ℃过夜，最后置液氮中长期保存。

组织复苏方法：遵从慢冻速溶的原则，将液氮中的冻存管取出，迅速置于37 ℃的水浴锅中进行快速溶解，并摇动冻存管加速冻存液溶解，解冻后将癌组织块取出，在超净生物台上用含有青霉素、链霉素的DMEM培养基将组织块冲洗后建模备用，癌组织冻存复苏后，应尽可能在30 min内完成。

2 肝癌PDX模型应用

抗肿瘤药物开发失败率高的最主要原因是缺乏合适的模型。目前相关药物的活性筛选主要通过体外培养细胞系和体内建立动物模型开展抗肿瘤实验[4]。评价药物的抗癌活性以及药物作用机制时，则利用肝癌HepG2和SMMC-7721细胞株筛选[5-6]，但还是以动物体内实验结果为主。鼠源性动物模型中，由于产生了巨大的生物学特性改变，无法保持与原发肿瘤的一致性，使得对药物活性的评价效果较差，新药的作用机制也不能准确反映实际患者体内药物的作用原理，因此在开展临床治疗方向的研究也存在一定障碍。Bissig-Choisat等[2]建立的肝癌PDX模型在连续传7代后，组织学分析显示仍然保留HB肿瘤组分并在连续移植模型中检测到这种肿瘤的罕见间充质成分。移植模型的癌组织由于仍然保留其正常的结构和功能，能够更准确地反映体内情况，是最为接近临床患者模型[7-8]。目前该模型已广泛应用于肝癌药物筛选、个体化治疗以及新治疗方向研发等多方面的应用。

2.1 药物筛选PDX模型做为理想的临床前模型广泛运用于肿瘤的基础与临床研究，特别是对传统、新型抗癌药物敏感性、检测肿瘤发生发展及侵袭转移的机制，寻找肿瘤新型标志物均有重要意义[9-10]。PDX模型对抗肿瘤药物的反应与临床反应基本平行，与体外实验相比具有更高的可靠性，已经应用于肝癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤的新药研发[11]。

陶其飞等在抗肝癌药物的筛选中，通过对比不同敏感性的肝癌PDX模型的表达谱，筛选了Sorafenib耐药性相关的标志物并初步探讨其耐药机制[12]。Huynh等[13]通过建立肝癌PDX模型对Cisplatin、Oxaliplatian、Iressa、SarCNU、Doxorubicin、维生素D类似物EB1089进行活性筛选，发现Cisplatin、Oxaliplatian、Iressa、维生素D类似物EB1089对小鼠肿瘤的生长速度没有影响，SarCNU、Doxorubicin有明显的抑制作用，并利用肝癌PDX模型对抗肿瘤药物Bevacizumab、Rapamycin进行疗效观察，发现Bevacizumab和Rapamycin联合用药比单一用药效果更好，能有效抑制肿瘤的生长[14]。Wang等对Rapamycin、Sorafenib抗肿瘤药物的疗效进行观察，发现rapamycin与Sorafenib联合用药时比单一用药效果更好[15]。由此可见，肝癌PDX模型作为新药开发的临床前模型，能够有效评估抗肿瘤药物的药效并阐明其作用机制，在新药研发过程中将发挥重要作用。

2.2 个体化治疗目前研究的抗肝癌药物主要包括酪氨酸激酶抑制剂Sorafenib、Regorafenib、Brivanib；小分子靶向抑制剂Tivantinib、Capmatinib；化疗药物Doxorubicin、Oxaliplatian等，然而进入肝癌临床试验的靶向药物中，很多药物被证实在总体人群中无效。即使在临床前实验中被证实Sorafenib具有很好的抗肝癌活性，但在临床应用中同样有约50%的患者无效，患者用药前无法判断其疗效[16]。其原因可能是同种的肝癌患者之间存在着个体差异，常规治疗方案往往无法获得疗效。因此针对不同患者优化个体化治疗方案是提高药物疗效的有效途径。肝癌PDX模型的建立将在其中发挥着重要作用。

陶其飞[12]利用肝癌PDX模型进行详细的基因组、表达谱特征描述，通过在患者肝癌组织中发现的常见变异基因找到对应的模型，为精准治疗方案提供了研究平台。黄昊等[17]利用肝癌患者术后肿瘤组织建立肝癌PDX模型并评价Sorafenib药效，同时对接受Sorafenib单药治疗患者进行临床观察，发现术后6个月肝癌出现复发，且伴腹腔淋巴结转移，这与建成的肝癌PDX模型的药效学评价结果相似，以此推断该患者先天对索拉非尼具有耐药性。可见肝癌PDX模型能更好地反映药物在个体化患者中的作用，该模型的建立对于抗肝癌活性的临床前评估、治疗方案的确定和预后具有重要的转化意义，有望为肿瘤患者个体化治疗带来新突破。

2.3 其它方面的应用肝癌PDX模型还用于研究肝癌的发生发展机制以及治疗方法等方面。有研究者证明OPN和EMT标记表达相互关联，具有侵袭性生长和转移的特性。RNA适配体与细胞的OPN结合，自分泌和旁分泌适配体能消除OPN与细胞表面结合。在移植模型中，RNA适配体能显著抑制肿瘤生长。分析在体外和离体环境中肿瘤细胞的表达显示出EMT的显着降低该适体的标记表达，OPN与细胞表面整合素受体的结合是EMT标记表达所需，OPN可靶向明显降低肝癌的EMT和肿瘤生长[18]。

目前，肝癌的治疗方法主要为肝切除、移植、化疗等，虽然治疗方法取得很大进步，但是几十年来，患者5年生存率一直保持在10%左右，因此亟需研发更加有效的治疗方法。Jiang等[19]利用肝癌PDX模型发现GPC3-CAR T细胞能够有效消除PDX中的肿瘤，GPC3-CAR T细胞疗法有望作为HCC的候选者治疗。Wang等[20]基于肝癌PDX模型研究利用纳米载体将siRNA传递到HCC，特异性的与肿瘤结合并显著抑制Luc基因的表达，为HCC的治疗提出新的方向。

3 肝癌PDX模型成瘤的关键因素与不足

3.1 肝癌PDX模型成瘤的关键因素研究发现肿瘤组织的分化程度与移植成功率呈正相关的关系，分化程度低，侵袭度高及易转移的肝癌组织更容易移植成功；反之，成瘤率则较低[21]。移植部位不同对成瘤率也有不同的影响，目前建模的移植部位主要为皮下移植和肝内移植。皮下移植操作简单，接种的部位在裸鼠的背部、腋下，选择血管较丰富的部位，易于监测肿瘤的生长，但皮下移植所生长的肿瘤不会发生转移。而由于原位移植癌组织的生长的微环境更接近于人体内的生长环境，保持原代肿瘤中的动态生长状况[22]，因此肝内移植是肝癌肿瘤移植模型研究的新方向。

除此之外，裸鼠的品种、年龄、饲养环境等因素都可能对成瘤率造成影响，目前建模选用的鼠种主要有NCG、SCID、NOD/SCID、BALB/c等免疫缺陷鼠。不同品系的裸鼠免疫力有差异，因此肝癌移植成功率也会有所不同。同时由于免疫缺陷鼠的饲养需要严格环境，宜饲养于SPF级的IVC笼具中，温度、湿度等多种因素都可能对其生长造成影响。另一方面随着年龄的增长，裸鼠自身会患有多种疾病导致裸鼠死亡，如BALB/c裸鼠老年心脏有某些病变，常因动脉硬化对成瘤率造成影响，部分SCID小鼠随年龄增长淋巴细胞功能恢复，对异物有排斥反应，同样影响成瘤率。

3.2 肝癌PDX模型不足PDX模型发展已有30多年的历史，由于移植肝癌组织保留了原代肿瘤的主要组织特征、突变位点、基因表达等特性，是目前较理想的肝癌模型，在新型药物的筛选、治疗方法的研究上已取得了一定的成效[23]。然而该模型也有一定的缺陷，因皮下移植瘤细胞生长微环境与原发肿瘤生长微环境有差异，影响肝癌细胞的表达，肝内移植生长环境虽然与原发性肿瘤生长环境相似，但肝内移植难以监测肿瘤生长的大小，且要求技术较高，易造成小鼠的死亡。其次，由于目前该造模方法花费时间长且成瘤率较低，临床上很难有足够的时间开展相关研究，这对实现个体化治疗将会是重大的挑战[24]。如何改善皮下移植肿瘤的微环境相似性和提高肝内移植成功率将是建立肝癌PDX模型的一个重要的研究方向。

另一方面，肝癌PDX模型的应用还存在物种差异问题，人和鼠两者间物种差异尚无法消除，因此仍有学者对肝癌组织移植的保真度仍然持怀疑态度。并且人肝癌组织在离体取材及剪切的处理、移植后适应宿主新环境等各方面是否会导致肿瘤的某些亚群选择性生长，是否能够完全保持人肝癌的生物学特性还有待验证。为了改善这一现状，近年来[25]，具有人类免疫系统的人源化PDX小鼠模型正在开发和应用。

4 展望

随着对肝癌模型研究的深入，研究者们更能清楚的认识到优异的肝癌模型对肝癌研究的价值。传统的肝癌动物模型已不能满足现有肝癌研究的需求，需要开发更切合人自身生物学特性的肝癌模型。肝癌PDX模型最大程度的保留了人类肝癌的生物学特性、组织病理学特征，决定了该模型在肝癌研究领域发挥重要作用，是目前最为理想的肝癌动物模型。Bissig-Choisat等[2]建立肝癌PDX模型，用mek1抑制剂trametinib和泛类I-pi3激酶抑制剂nvp-bkm120靶向治疗侵袭性肝细胞恶性肿瘤，结果发现可显著抑制其生长，从而证实肝癌PDX模型是研究肿瘤生物学和患者肿瘤特异性的一个有价值的工具。肝癌PDX模型已应用药物筛选、药物疗效评价、肝癌的发生发展等多方面的研究，其它方面潜在的应用价值也在逐步的挖掘。

由于肝癌PDX模型能更直接、客观地将肿瘤自身生长环境以及疾病发展情况展现出来，因此对临床上研究具有高度的相关性。与其它肝癌动物模型相比，肝癌PDX模型取材于不同的患者，保留了患者肿瘤的异质性符合肿瘤生物学治疗基本原则，为个体化抗癌治疗方案的制定，实现肝癌患者的精准用药提供了可能，同时为抗肿瘤药物研发、药效评价、新的治疗方法的研发也提供一个新的平台。