影响悬浮细胞冷冻保存活性的因素分析

吴敬智，缪着，马波，刘馨

作者单位：650500 昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室（吴敬智、缪着、马波、刘馨）；650106 昆明时光肌生物技术有限公司（马波、刘馨）

近年来，随着再生医学的发展，细胞治疗得到越来越多关注，冷冻保存方案在再生医学和细胞治疗方面有巨大潜力。冷冻保存是利用低温保存结构完整的活细胞来实现后续细胞治疗的迫切需要。目前冷冻保存技术的使用和生物库行业的需求在不断增加，迫切需要现代化和成熟的冻存手段来改善细胞冻存质量，为细胞治疗提供保障。早期研究发现了解细胞冻存损坏机制和冻存条件对冻存效果至关重要。本文对悬浮细胞冻存机制、冻存过程中细胞骨架的受力和细胞器的损伤变化；影响悬浮细胞活性的冻存因素；以及造血干细胞、外周血单个核细胞和自然杀伤细胞的深低温保存研究进展，细胞冻存后的生理生化特点进行综述。

1 细胞冻存和复苏基本原理

1.1 细胞冻存

低温下，活细胞中的生物和化学反应都会大大降低，为细胞长期冻存提供了可能。冷冻对大多数活生物体都是致命的，细胞冻存是利用冷冻保护剂来降低冰点，缓慢冻结细胞的过程中，细胞内水分透出细胞，使细胞冻结中冰晶形成减少，从而避免了由于冰晶形成对细胞中生命活性物质的一系列损伤。此外，细胞冻存的理论认为，细胞在低温环境可以抑制细胞的呼吸和体内相关酶的活性，降低细胞代谢，保持细胞遗传特性[1]。

1.2 细胞复苏

解冻程序会显著影响冻存后细胞生存能力和细胞恢复，评估活性和活细胞回收率是评价方法性能的必要条件。解冻时间、洗涤介质、温度、离心时间和离心力等都会影响冻存后细胞的复苏[2]。①复苏温度：通常细胞的冷冻复苏是放在 37 ℃ 水浴中快速化冻，融化到能看见少量冰存在时取出或者直接等冰全部融化。②洗涤液的温度：Ramachandran 等[3]研究将冰冷的洗涤介质直接添加到融化的细胞中与将洗涤介质加热到 37 ℃ 再添加相比，回收的外周血单核细胞（PBMC）的活力和功能明显降低。Disis 等[4]在 PBMC 冷冻保存淋巴细胞保持其功能影响的研究中，洗涤液冷却至 4 ℃ 时，平均生存力仅为（69.7 ± 12.5）%，在 25 ℃ 下为（92.55 ± 3.1）%，在 37 ℃ 下为（95.11 ± 2.5）%，因此，洗涤液预热至 37 ℃ 能更好地保持细胞的活率。③洗涤介质的选择：在洗涤介质中使用胎牛血清时，要考虑批次间生物学差异以及动物来源材料存在的风险。④离心力和离心时间：降低离心力和时间会产生更高的生存力和更低的活细胞回收率。

2 细胞冻存的损伤机制

2.1 细胞冷冻受力作用

细胞冻存损伤机制主要有细胞内冰的形成（IIF）（即快速冷冻过程中细胞内水的冰结晶）、细胞外冰的形成（EIF）和溶液效应（渗透压梯度驱动的细胞缓慢冷冻时脱水）[5]，这些机制使细胞生理结构发生变化，从而导致细胞机械约束和损伤。细胞在冻存时面临各种机械力作用，其中细胞膜和细胞骨架以及它们之间的相互作用是细胞自身调节和适应细胞不受破坏的关键因素。细胞膜上的蛋白复合体可以直接感应细胞内渗透压的变化，从而改变膜上蛋白和脂质体的相互作用，影响通道蛋白的开放和关闭，维持平衡[6]。膜骨架有抵抗机械力和保护细胞膜的作用，它为细胞膜提供结构支撑，能保持细胞反复变形中的完整性[7]，细胞应对外力的早期保护性反应中，细胞膜、膜骨架和整个细胞骨架通过相互作用交联形成三级聚合体结构[8-9]，力作用于细胞时就会分布在各种细胞结构和位置上，通过多种方式来感知力并生成信号控制重塑过程，同时细胞内也存在着具备感应机械力信号的细胞器[10]，如整合膜受体将机械刺激传导入细胞，提高细胞保护性骨架蛋白的表达量[11]。其次，膜骨架在蛋白组成和结构上与多种跨膜蛋白镶嵌在细胞膜上，具有限制膜蛋白和脂质活动的相互作用包括水/冰的相变而引起的 ECM 的体积膨胀与相邻未冷冻 ECM 的压缩，从冷冻界面到未冷冻 ECM 的组织液运输以及细胞与 ECM 之间的机械应力/应变相互作用[12-13]。

2.2 细胞骨架的破坏

细胞骨架是一种超微网络结构，由蛋白质纤维组成，它贯穿细胞，用于支持、运输和运动。细胞骨架是低温保存过程中损伤的靶点，悬浮细胞的低温保存通常采用缓慢冷却和快速升温的方法。复杂细胞系统和简单细胞悬浮液在对冷却、升温和脱水的反应方面的差异会影响保存质量。低温保存过程中渗透应力和相变引起的潜在损伤是细胞间的紧密相互作用导致的[14]。如肌动蛋白作为动物细胞中三种细胞骨架之一，它为细胞质的许多力学性质提供了分子基础，细胞质是一种复杂的粘弹性材料，肌动蛋白高度集中质膜下，富含肌动蛋白的层面控制着大多数动物细胞的形状和表面 运动，对质膜的任何机械损伤可能破坏肌动蛋白[15]。所以了解细胞对冷冻过程的超微结构反应对于设计细胞的冷冻保存策略具有重要意义。Malpique 等[16]采用超高黏度海藻酸钠凝胶包埋的低温保存方法保存 Caco-2 和 N2a 细胞系，结果表明在海藻酸钠层下的包埋可减少细胞解冻后膜的损伤和细胞的脱落，避免了从表面分离和细胞-细胞相互作用的破坏，提高了代谢活性和功能的恢复。

2.3 细胞器的损伤

在冷却条件下，质膜可能是冷冻损伤的主要部位[17]，质膜提供了细胞内外环境之间的物理分离，对质膜的损伤将导致质膜功能固有的屏障、门控和信号传递过程的中断。受损的质膜和随后的半渗透性丧失是细胞致命损伤的指标。两种最常被考虑的低温损伤类型是冰晶对细胞膜的直接或间接损伤和冰晶周围未冻结部分的高溶质浓度影响，这可能导致细胞蛋白变性或脂质双层膜损伤[18]，此外，脂质双分子层膜本身在冷却时会发生相变和结构变化[19-20]。其次，细胞间质内含水分较多，组织疏松，密度较低，冰晶极易在细胞间质中形成冰晶，在疏松的细胞间质中滞留后，对细胞间质造成损伤。继细胞间质受损后，线粒体开始受损，首先是 线粒体嵴被破坏，嵴消溶，而线粒体质膜却保持完好，这 可能与线粒体内的糖、脂肪和蛋白质的分解代谢有关。糖、脂肪和蛋白质在各自的分解代谢过程中，最终都有水形成，使线粒体内含有较多的水分，因而当冷冻速率下降后，冰 晶极易在线粒体内形成，对嵴产生挤压损伤[21]。冻融引起的线粒体损伤，可能导致线粒体功能衰竭，可通过形态学改变、细胞外基质均匀性和密度降低、外膜破裂和颗粒消失来观察[22-23]。溶酶体在冷冻后也会破裂，Huebinger[24]通过荧光显微镜对冷冻前后吖啶橙标记的 HeLa 细胞的溶酶体完整性进行检测，这些细胞中有 90% 显示了两个或更少的溶酶体，其余 10% 的溶酶体数量也异常少，这表明在快速冷冻保存后溶酶体在细胞内也会破裂。

3 悬浮细胞的冻存及其影响因素

3.1 悬浮细胞的冻存

细胞的悬浮冻存可以从外部冷冻介质的结冰和细胞对环境变化的反应来理解。首先，冻结水溶液时，水溶液中冰的形成导致溶质在残余液体中的再分布；其次，悬浮细胞与固-液界面的相互作用可能会导致细胞立即被冰冻封装，单个细胞在冷冻过程中有对不断变化的环境的反应，如渗透性引起的失水可能导致细胞显著收缩，若细胞内有足够的水，则可能发生细胞内结冰，导致严重的细胞损伤。此外，通过测定受损细胞的百分比可以初步评价细胞的冻存效果[25]。文献[26-27]所述，可以使用荧光分析检测细胞的生存力，但荧光分析基本上只决定膜的完整性，并不表明功能特性和长期生存能力。冻存可能会影响细胞的功能和表型，但也存在以下优势：冷冻保存细胞的使用可以根据患者的临床情况提供更多的计划灵活性；产品质量可以在输注前进行质量控 制测试来提高治疗安全性；细胞的大规模商业应用目前还需要使用来自大型冷冻设施的冷冻保存[28]。

3.2 细胞冻存影响因素

细胞冻存受很多因素的影响，比如冷冻保护剂、冷冻温度、冻存密度、冻存方式等。①冷冻保护剂（cryoprotective agent，CPA）：是一种加入冻存培养基中以避免冻存伤害细胞的化合物，是几乎所有细胞冻存操作规范中的必备试剂。对细胞冻存的研究也大多集中在冻存液。目前，冷冻保护剂主要有渗透型和非渗透型两种，渗透型冷冻剂包括二甲基亚砜、甘油、甲醇、乙二醇等，它们通过溶剂效应降低细胞内电解质的浓度，降低冰晶；非渗透型冷冻剂包括聚乙烯吡咯酮、羟乙基淀粉、聚乙二醇、蔗糖、葡聚糖和白蛋白等，它们通过增加细胞外渗透压，减少细胞内水分含量，降低了冰晶[29]。二甲基亚砜（DMSO）是最常用的冻存剂，但高浓度的 DMSO 对细胞具有毒害作用，故后来采用其他冻存剂或减少 DMSO 的方式，降低溶液中 DMSO 的浓度，从而减少对细胞的伤害。②冷冻温度：目前用于冻存细胞的温度由 -80 ℃ 到 -196 ℃ 不等，经典的细胞冻存方法用10% 二甲基亚砜、-196 ℃ 液氮程序保存。近年来 -80 ℃ 的冰箱深低温冻存应用越来越多，该方式所需设备简单，冷冻费用低，容易掌握[30]。Han 等[31]研究了两个关键的冷冻保存参数的影响：冷冻温度和相应的冷却速率；冷冻保护剂（CPA）在 ECM 微观结构上的浓度以及细胞活力结果表明，随着冷冻温度的降低（即快速冷冻），细胞扩张明显增加，随着 DMSO 的使用，膨胀减小，并且观察到 DMSO 有冷冻温度依赖性阈值浓度，DMSO 的阈值浓度随着冷冻温度的降低而增加。此外，对嵌入细胞外基质（ECM）中的细胞骨架结构进行调节可以减轻冷冻诱导的功能变化，减少在冷冻保存过程中保留工程组织（ETs）功能所需的 CPA 量[32]。③冻存密度：不同的细胞冻存密度有所不同，过高的冻存密度会影响其冻存效果而间接影响细胞的复苏应用，而过低的冻存密度因为增加冻存体积而大大提高冻存成本。④冻存方式：缓慢冷冻和玻璃化是细胞冻存的常用方式。缓慢冷冻首先用冷冻保护剂（CPA）代替细胞质内的水，从而减少细胞损伤并根据细胞膜的通透性调节冷却速率。玻璃化过程需要将细胞或组织暴露于高浓度的 CPA（比例为 40% ～ 60%）后冷却至深低温（即液氮），并随后进行快速冷却以避免冰成核[33]。相较于缓慢冷冻，玻璃化冷冻损伤的风险低。

4 外周血单个核细胞、造血干细胞和自然杀伤细胞的冻存

4.1 外周血单个核细胞的冻存

外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）作为人体免疫系统功能的重要组成部分，其相关单体细胞在人体内含量很少，需要对其进行体外培养扩增才能得到临床所需数量和质量的细胞，储存问题也是影响临床发展的重要因素。PBMC 的冻存方法对其活性的影响已有较 多研究。首先，冷冻剂的必要性，Sultani 等[34]研究加入了渗透性和非渗透冷冻保护剂[二甲基亚砜（DMSO）和羟乙基淀粉（HES）]，两种 CPA 联合使用取得了更好的效果。在冻存剂添加一定量的血清，可能会中和 DMSO 的毒性。黄馨萍等[35]利用含两种不同血浆浓度（40% 和 90%）的冻存液对单个核细胞冻存后进行细胞计数、台盼蓝拒染实验和集落形成能力检测分析，得出冻存液中血清含量越高，冻存效果越好。同时得出，无论血浆浓度是 40% 还是 90%，两类冻存剂的细胞活率均超过 90%，还提示含 10% DMSO 的冻存剂是冻存液的关键因素。联合保护剂作为 PBMC 新的冻存手段，能减少单一成分的副作用，如低分子右旋糖酐输注在临床上原本被用于扩充血容量，与 DMSO 的联合使用能发挥叠加或协同低温保护作用[36]。有研究还对比不同浓度的甘油和 DMSO 的冻存效果，发现 DMSO 浓度在 10% ～ 15% 范围内，冻存效果均能使细胞活率达到 86% ～ 95%，甘油浓度在 61% ～ 65% 范围，冻存效果更优良[37]。其次，冻存方式的应用。有研究比较程控降温和非程控降 温的运用，采用程控降温法逐级降温对细胞的冻存比较有 益[38]。也有将 PBMC 细胞加入冻存液充分混匀后转移到冻存管中，先将冻存管放入 -80 ℃ 冰箱，24 h 后转入液氮中保存[39]。朱彤等[40]在 -150 ℃ 液氮中保存外周淋巴细胞两年，细胞仍能够保持 95% 以上的活力。冻存细胞的密度也会影响冻存效果，林科佳等[41]通过比较 PBMC 三种冻存密度，即 2.0 × 107/ml，4.0 × 107/ml 和 6.0 × 107/ml，得出采用 2.0 × 107/ml 密度冻存的细胞冻存后培养效果较好，采用 4.0 × 107/ml 和 6.0 × 107/ml 密度冻存后细胞扩增倍数均与未冻存细胞有一定差异。

4.2 造血干细胞的冻存

造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）来源于骨髓、外周血和脐带血[42]。自第一次骨移植以来[43]，造血干细胞移植已应用于各种造血系统先天性或后天性疾病的治疗。造血干细胞在临床使用之前，必须按照精确、有效的程序将其冷冻并保存在适当的条件下。影响 HSC 冷冻保存成功的因素包括冷冻速率、预冷冻保存条件、冷冻保护剂、冻存前放置时间等[44]。在接受细胞疗法的患者中，HSC 冷冻保存的大部分研究都集中在减少或去除 DMSO 毒性问题上，有相关临床前研究和临床研究表明 DMSO 浓度（10%、7.5% 和 5%）用于超低温保存 HSC，浓度低于 10% 时，有核细胞回收率降低；7.5% 和 10% 浓度时，不良事件的发生率没有变化，5% DMSO 冷冻细胞的患者中，诸如恶心、发烧和心动过速等不良反应最低[45-47]。用羟乙基淀粉（HES）和葡聚糖与 DMSO 混合能显著改变 HSCs 的冷冻保存效果[48-49]。还有研究表明添加无血清的无外源培养物可以大大提高这些细胞的冷冻保存效率，提高冷冻保存液的抗氧化和生化性能[50]。宋腾飞[51]研究发现冻存前放置时间对造血干细胞中 CD34+百分率也有影响，对单采后血细胞分别进行采集后 0、24、48、72 h、＞ 72 h 的台盼蓝拒染率及 CD34+百分率进行检测分析。结果显示，台盼蓝拒染率随着时间的 推移呈上升趋势，在 72 h 内较稳定，＞ 72 h 后下降明显，建议采集的细胞尽量在 24 h 内冻存处理，最长不要超过 72 h。冻存温度的影响：在 -80 ℃ 机械冰箱中冷冻造血干细胞会导致一些基因的上调[52]，细胞膜完整性和克隆形成潜能显著丧失[53]，对造血干细胞和患者的临床结果产生不利影响，在 -196 ℃ 的液氮中保存比在 -80 ℃ 的机械冰箱中存活率更高[54]。在冻存方式上，Antoniewicz-Papis 等[55]比较两步法和可控冷冻法冻存脐带（CB）来源的造血干细胞，重点对 MNC 计数、CD34+细胞计数和生存力作为 CB 移植材料常规质量控制的解冻后变量进行了评估。此外，细胞浓度也会影响冷冻效果，细胞浓度过高可能导致解冻后 细胞丢失和细胞聚集，或在细胞输注过程中引起癫痫发 作[56-57]。

4.3 自然杀伤细胞的冻存

自然杀伤细胞是机体重要的免疫细胞，作用机制基于免疫调节细胞因子的释放，如干扰素 γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α），或死亡受体配体结合诱导依赖 caspase 的细胞凋亡，或分泌细胞毒性颗粒。对于临床使用的 NK 细胞，大规模生产高度纯化的 NK 细胞和具有相当的细胞毒性活性至关重要，冷冻保存为临床需求的大量 NK 细胞治疗提供了基础。冷冻保存扩增的 NK 细胞已显示可减少 NKG2D 和 TRAIL 的表达和细胞毒性[58]。Min 等[59]通过对有或没有冷冻保存的离体扩增的 NK 细胞的功能活性、细胞表型、体内抗肿瘤活性及其 ADCC 活性比较，研究发现：①冷冻保存 NK 细胞降低了细胞活力，但没有降低细胞毒性活性和细胞因子分泌活性；②趋化因子受体的表达没有改变；③降低了 NK 细胞的抗肿瘤活性，但通过剂量控制可以克服；④添加利妥昔单抗可增加冷冻保存的 NK 细胞在扩增后的细胞毒活性。Lapteva 等[60]冷冻保存 NK 细胞 12 个月后，扩增和冷冻的 NK 细胞也能发挥功能，但融化 NK 细胞后，需静置过夜，否则它们不会立即裂解 K562 细胞。Pross 和 Maroun[61]把冷冻融化的淋巴细胞在培养基中静置 5 h，恢复了细胞毒性功能，所以细胞活性和功能可能需要一定的恢复期。目前已经开发了糖、氨基酸、多元醇和两性电解质作为低温保护剂，如 El Assal 等[62]开发了根据生物相容性原理开发的冷冻保护剂，如葡聚糖和羧化 ε-聚-L-赖氨酸（CPLL）混合物结合慢速冷冻方法，冻存后与基于二甲基亚砜的冷冻保存的质量相当，且具有更低的细胞毒性。最新研究发现，一种基于生物相容性壳聚糖纳米颗粒被设计用来介导无 DMSO 的高效低温保存 NK 细胞，以这种方式低温保存 NK 细胞保留了针对肿瘤目标的强细胞毒性、脱颗粒和细胞因子生成功能[63]。

4.4 细胞冻存生理生化特点

细胞低温保存为保持细胞株遗传的稳定性以及非连续性使用细胞提供了可能，同时细胞冻存后在生理生化方面 也有一些变化。Keane 等[64]研究低温保存对细胞生物能量学的影响发现，在冷冻保存和复苏后，低温贮藏使细胞活力降低了 20%，线粒体功能受损，表现为基础呼吸、ATP 产 生、最大呼吸、储备能力和耦合效率下降。而细胞似乎更 依赖于糖酵解，糖酵解效率较低，但能迅速生成 ATP。但线粒体产生 ATP 较少，发生的机制可能包括 ATP 需求量 低、底物利用率有限，或者更有可能损害氧化磷酸化（OxPhos）机制[65]。此外，细胞复苏后，从氧磷到糖酵解似乎发生了代谢转换。这可能是一种适应机制，以补偿线粒体活性下降，导致一种能力以应付细胞的 ATP 需求。然而，还必须注意的是，低温储存还可以改变离子转运蛋白的活性，如调节细胞内 pH 的 Na+/H+反转运蛋白和 HCO3-/Cl-交换器[66]。

综上所述，悬浮细胞最佳冷冻保存需要考虑多种因素，包括冷冻保护剂溶液的组成、细胞浓度、冷冻速度和保存温度，尤其对细胞冷冻和复苏的原理及其相关影响因素进行充分考虑，这些都会最终影响细胞冻存的效果，随着近年来细胞治疗的流行，需要对细胞深低温保存的方法进行优化改进。此外，还需要对冻存后复苏细胞的存活率、功能性以及安全性进行相关质量评价。