简论高效液相色谱峰异常现象

2020-01-13赵胜延张秉慧宋艳真付梦飞

中兽医学杂志 2020年8期

赵胜延，张秉慧，宋艳真，付梦飞，施萍

（1.河南省畜产品质量监测检验中心许昌分中心，河南许昌461000；2 许昌市动物疫病预防控制中心，河南许昌461000）

液相色谱是利用混合物中各组份在不同两相中溶解、分配、吸附等化学作用性能的差异，当两相对运动时，使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离，两相中有一相是固定的，叫作固定相，有一相是流动的，称为流动相。该方法逐渐更多地收编入《中华人民共和国兽药典》，广泛应用兽药检验检测中，如中药黄芪多糖注射液、板蓝根注射液的含量检测，部分兽药的性状鉴别。该方法是一种在定性基础上需有纯物质作为标准物质的相对定量分析。大多情况下，只要检测方法、仪器条件设置正确，都能达到理想分析结果，但实践中由于种种原因，存在目标峰未出现、峰形异常、保留时间漂移等现象。现就笔者工作中遇到的问题，进行归纳、整理、分析，总结如下，供同行参考。

1 未出现目标峰

1.1 色谱柱的选择如方法规定C18 色谱柱，由于粗心错用了C8 色谱柱，因固定相的不同，使样品中被测成分不能在固定相中被分离和吸附。

1.2 流动相使用不当流动相是携带待测物质向前移动的物质，对待测物质具有一定的溶解能力，且不与待测物质发生化学反应，若流动相选择错误，致使待测物质不能在固定相中被吸附和分离。

1.3 检测器选择不当检测器大致分紫外、荧光、示差、二极管检测器等，每种物质都有自身特性，有的有紫外吸收基团，有的是荧光基团，具有荧光性的物质，需要激发和发射波长，如检测鸡蛋中氟喹诺酮类物质，物质的自身特性，只能用荧光检测器时行检测。

1.4 进样问题未进样或样品分解，日常工作中，有时会工作疏忽，未设置进样体积，或样品处理时间过长，比如注射用青霉素，样品处量后长时间未能及时进样，造成主药成分降解。

2 峰形异常

2.1 双肩峰或分叉双肩峰的出现，不但改变了形状，保留时间也不稳定。样品在处理时浓度过大或进样体积过大而导致的过载、预柱或色谱柱污染、柱塌陷、进样器损坏都会出现这种情况。消除办法：降低样品浓度、更换色谱柱、更换进样器转子。

2.2 前伸峰前伸峰的出现，使峰形严重不对称，影响积分数据处理，造成检测结果产生误差。多见于进样量或样品浓度过大、溶样的溶剂相对于流动相太强、保护柱或色谱柱污染或失效、柱温等有关。因此样品在处理时要用流动相作溶剂，严格按标准设定进样量。

2.3 拖尾峰拖尾峰形状与前伸峰形状相反，对检测结果产生的影响相同，形成原因，多与柱超载、峰干扰、死体积过大、柱效下降、柱塌陷、检测器时间常数不正确等有关、消除办法：选择合适样品量，清洁样品、调整流动相，连接点降至最低，更换色谱柱等。

2.4 色谱峰出现多峰现象检测检验中往往会出现比目标峰多的峰，这些峰的出现，有时并不影响对检测结果的积分定量，但会干扰对主峰的判断。原因：未充分平衡进样器LOOP 管、进样器污染、前次进样的后流物未被冲洗出来、保护柱脏、色谱柱污染、流动相被污染或用错流动相、样品分解或制样进引入了杂质。认真分析都不难排查和解决。我们在制样环节做到一样品一清理，保证样品无污染。洗针液要用强洗液，并保证洗针液数量充足。进样时间设置合理，使目标物的出峰时间足够长。流动相用前过0.2um 膜过滤，除杂质，保证保护柱干净。样品的浓度和进样量不能过高，避免色谱柱污染。

3 保留时间漂移

样品在进样过程中，会出现被测物质的出峰时间与标准物质相差较大，以标准物质建处理方法进行积分时，出现样品峰丢失，导致无法积分定量，影响结果分析。形成原因：柱子平衡时间不充分，系统不稳定。泵头里有气泡，造成泵压力不稳，脱气机故障，脱气不充分。温度波动过大，尤其样品量大时，运行时间过长，当温度降低或升高时，往往会造成保留时间向后或向前漂移。样品浓度或进样体积过大。另外流动相混合不均匀、色谱柱污染时，都会造成保留时间不稳定。所以在进行实验时，上机前要充分混合流动相。平衡色谱柱之前，一定要进行充分湿冲或干冲，达到充分排气，同时要开启脱气机，保证整个液路无气泡。平衡色谱柱时，对于长时间不用的，进样前要平衡至少1 小时，经常使用的仪器，要平衡至少半个小时。开机同时，要保证室温度稳定，对附带有柱温箱的仪器，要在仪器方法中设定合适温度。样品的上机浓度要严格按照国标要求，不可随意增大浓度或进样体积。样品量过多时，进样时要每隔10 针运行一针标准物质。