免疫检查点抑制剂联合溶瘤病毒治疗三阴性乳腺癌研究进展

张 幻，谢伟敏

（广西医科大学附属肿瘤医院乳腺及骨、软组织肿瘤内科，广西 南宁 530021）

乳腺癌是威胁女性健康的最主要因素。美国癌症协会最新统计数据表明，自2004年以来，乳腺癌发病率逐年上升，是20～59岁女性癌症患者主要的死亡原因［1］。在乳腺癌分型中，三阴性乳腺癌（triplenegative breast cancer，TNBC）发病率占全部乳腺癌的15%～25%。我国的发病率约为23.8%［2］。TNBC是指雌激素受体、孕激素受体和人类表皮生长因子受体2均为阴性的乳腺癌［3］。由于其激素受体和人类表皮生长因子受体2均为阴性，且具有较高的基因组不稳定性和较高的突变率［4］，其内分泌治疗和传统靶向治疗的疗效甚微。目前，临床上最常用的治疗手段以手术和化疗为主。化疗常用药如紫杉烷、蒽环类和铂类药物，但长期疗效并不理想。TNBC发展迅速，容易转移和复发。转移性TNBC患者的5年存活率不足30%［5］。因此，需要突破传统治疗的瓶颈。

免疫治疗是一种全新的肿瘤治疗模式，其主要机制为改变肿瘤免疫耐受的微环境，重新激活机体自身的免疫功能，从而发挥杀灭肿瘤细胞的作用。近年来，肿瘤的免疫治疗研究日新月异。2013年，以免疫检查点抑制剂程序性死亡受体1（programmed death 1，PD-1）抗体为代表的肿瘤免疫治疗被Science期刊评为年度最瞩目的科学突破，有望引领肿瘤治疗领域的一场革新［6］。免疫检查点抑制剂和肿瘤疫苗等主动免疫治疗手段、嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（chimeric antigen receptor T-cell immmunotherapy，CAR-T）和过继免疫治疗等被动免疫治疗策略以及溶瘤病毒（oncolytic virus）疗法等等，均已在多种肿瘤类型中显示出了强大的抗肿瘤活性。目前为止，美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）已批准大量用于恶性肿瘤的免疫治疗药物。例如，2006年PD-1抑制剂纳武单抗（nivolumab，商品名Opdivo）首次进入临床试验，获得了37.5%的阳性有效率［7］。2011年美国FDA批准了第一个治疗黑色素瘤的免疫检查点抗体伊匹单抗（ipilimumab，商品名Yervoy）。靶向CD19的经过基因改造的CAR-T细胞在B细胞白血病的治疗中以>90%的总体有效率（overall response rate，ORR）成为世界关注的焦点［8］。2015年美国FDA批准的第一个治疗癌症的溶 瘤 病 毒（Talimogene laherparepvec，T-Vec）可优先感染和杀伤肿瘤细胞［9］。2013年开展关于不可切除黑色素瘤的Ⅲ期临床试验（NCT00-769704），ORR较对照相显著升高（26.4%vs5.7%，P<0.01），再次证实了T-Vec具有良好的抗肿瘤效应［10］。对于TNBC这种基因组不稳定的乳腺癌亚型，从免疫疗法中寻找多靶点多机制的联合疗法可能获得更加显著的疗效。本文综述了溶瘤病毒、免疫检查点抑制剂及其联合疗法在TNBC治疗中应用的进展。

1 溶瘤病毒治疗

溶瘤病毒是一类具有自我复制能力、能利用肿瘤细胞中抑癌基因的失活或缺陷，从而在肿瘤细胞中大量复制、导致肿瘤细胞裂解和死亡的病毒，但其对正常细胞无杀伤作用。溶瘤病毒大致分为2类，一类是未经基因编辑的天然病毒，如呼肠孤病毒（reovirus）、新城疫病毒（Newcastle disease virus）和天然柯萨奇病毒A21（Coxsackie virus A21）等；另一类是经过基因编辑的病毒，如腺病毒（adenovirus）、单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）和牛痘病毒（vaccinia virus）等［11］。

随着基因工程的迅猛发展，溶瘤病毒可作为基因载体携带外源性抗肿瘤基因，不仅能在肿瘤内复制直接溶瘤，释放大量肿瘤抗原激活机体抗肿瘤免疫反应，还能通过表达大量相关因子，进一步增强抗肿瘤免疫的作用［12］。已有研究表明，溶瘤病毒可通过静脉注射激发机体抗肿瘤免疫反应，不仅能引起肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lympho⁃cytes，TIL）增加，还能使肿瘤内程序性死亡配体（programmed death ligand-1，PD-L1）的表达上调，显著延长小鼠生存时间［13］。ZHUANG 等［14］通过HSV-1联合多柔比星治疗4T1原位移植瘤小鼠的动物实验发现，无论是溶瘤病毒单一治疗还是与多柔比星的联合治疗，均能抑制肿瘤的生长，延长小鼠的中位生存期，且联合治疗的效果更好。乳腺癌干细胞往往具有高活性的乙醛脱氢酶，与化疗耐药和不良预后有关。体外实验表明，HSV-1联合多柔比星可有效杀伤抗多柔比星的乳腺癌干细胞［15］。

溶瘤病毒的抗肿瘤作用不仅取决于单纯的溶瘤作用，还依赖于病毒激活诱导的抗肿瘤免疫［16］。因此，溶瘤病毒局部治疗也可对远隔部位肿瘤或者转移瘤发挥抑制作用。在MDA-MB-435S小鼠原位乳腺癌模型中，NORMAN等［17］研究发现，呼肠孤病毒局部注射不仅能使局部肿瘤缩小，还能治疗对侧肿瘤，提示溶瘤病毒局部治疗可产生全身抗肿瘤反应。GIL等［18］研究表明，携带趋化因子基质细胞衍生因子1的特异受体抑制剂的溶瘤痘苗病毒，可显著抑制小鼠4T1 TNBC原发灶的进展，并且在切除原发肿瘤后系统注射溶瘤病毒，可抑制自发转移，延长无瘤生存期。KIMATA等［19］对6例有皮肤或皮下转移瘤的乳腺癌患者瘤内注射构建的新型单纯疱疹病毒HF10，组织病理学评估发现，30%～100%癌细胞死亡并且患者未出现明显的不良反应。该项临床研究初步表明，HF10对转移性乳腺癌是安全有效的。

综上所述，溶瘤病毒溶瘤特异性高，可纠正TNBC中肿瘤相关微环境内的免疫缺陷，消除抗肿瘤免疫抑制，还能产生免疫记忆，在非临床动物模型实验中疗效显著。但要转化为临床应用仍存在许多问题，如瘤内注射的给药途径限制其只适用于浅表性肿瘤，静脉注射的给药途径由于免疫系统的干扰会被清除殆尽。但溶瘤病毒单药治疗凭借其强大的抗肿瘤活性和轻微的不良反应，使其有潜力与其他药物联合应用以进一步增强抗肿瘤效果。

2 免疫检查点抑制剂治疗

免疫检查点是抑制信号传导途径的共刺激分子，主要作用是防止T细胞过度活化所引起的正常组织损伤，在人体免疫系统中起到保护作用。肿瘤细胞可以上调免疫检查点分子及相关配体的表达，抑制T细胞的活化，抑制抗肿瘤免疫作用。在肿瘤免疫治疗研究中，应用最广泛的靶点包括PD-1及其配体PD-L1和PD-L2及细胞毒性T细胞相关抗原 4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA4）等。PD-1是一种表达于免疫效应细胞表面的抑制性跨膜受体，属于CD28家族成员［20］。在肿瘤微环境中，PD-1在活化的T细胞上高表达，PD-L1则在肿瘤细胞上广泛表达，肿瘤细胞表面的PD-L1与活化T细胞表面的PD-1结合后会导致PD-1通路的持续激活，使T细胞杀伤肿瘤的功能受到抑制，诱导肿瘤细胞实现免疫逃逸［21］。CTLA-4是一种白细胞分化抗原，也是T细胞上的一种跨膜受体。CTLA-4与CD28共同享有B7分子配体，与B7分子结合后抑制T细胞活性，从而抑制机体免疫反应［22］。

研究表明，TNBC中PD-L1表达水平高于其他乳腺癌亚型，约为19%［23］，提示PD-1/PD-L1抑制剂可有效治疗TNBC。LOI等［24］通过乳腺癌小鼠模型发现，MAPK和ERK激酶抑制剂能加强体内外TNBC细胞表面的PD-L1的表达，联合应用MAPK和ERK激酶和PD-L1/PD-1抑制剂能显著增强TNBC小鼠的抗肿瘤免疫反应。同样，临床研究也证实PD-1/PD-L1抑制剂的有效性。KEYNOTE012Ⅰb期研究首次报道，抗PD-1单抗单药可成功治疗TNBC［25］。该研究共纳入27例PD-L1阳性的转移性TNBC患者，接受派姆单抗（pembrolizumab，商品名Keytruda，美国批准的首个抗PD-1药物）治疗，ORR为18.5%，中位无进展生存期（median progression free survival，mPFS）为1.9个月，中位总生存期（median overall survival，mOS）为10.2个月。其后的KEYNOTE-086则继续评估派姆单抗作为后线治疗及一线治疗的有效性与安全性。队列A［26］募170例已经过治疗的TNBC患者，将派姆单抗作为二线或更晚线治疗。在不考虑PD-L1是否高表达的情况下，ORR为5.3%，mPFS为2.0个月，mOS为9.0个月。队列B入组52例PD-L1阳性转移性且未经治疗的TNBC患者，将派姆单抗用于一线治疗。结果显示，ORR为23.1%，mPFS为2.1个月，mOS为18.0个月。上述研究表明，派姆单抗作为PD-L1阳性转移性TNBC患者的一线治疗药物，表现出更强更持久的抗肿瘤疗效。另外，还研究发现，TIL水平与派姆单抗疗效呈正相关，具有较高水平TIL的患者，其ORR显著提高。

TONIC研究［27］纳入50例接受了≤3线姑息治疗并且出现疾病进展的转移性TNBC患者，接受纳武单抗治疗。结果显示，ORR为22%，临床受益率为26%，中位应答持续时间（median duration of response，mDOR）为10.9个月。结果提示，短疗程放疗或低剂量化疗诱导后给予纳武单抗治疗初显疗效。

伊匹单抗是第一个人源抗CTLA-4抗体，2011年3月美国FDA批准用于治疗晚期黑色素瘤。MC ARTHUR等［28］发现乳腺癌术前肿瘤冷冻消融术联合伊匹单抗治疗表现出诱导和协同性抗肿瘤作用，并且这种联合治疗包括伊匹单抗介导的免疫调节作用在乳腺癌患者中是安全并可耐受的。

免疫检查点抑制剂克服了因肿瘤细胞免疫逃逸造成的免疫抑制状态，激活并增强了抗肿瘤免疫应答。但既往临床试验证实，单一免疫检查点抑制剂治疗对TNBC的整体疗效有限。因此，能增加TIL浸润和免疫检查点表达的联合治疗模式会为TNBC的治疗提供更广阔的前景。

3 免疫检查点抑制剂联合溶瘤病毒治疗

显著的免疫疗效依赖于肿瘤微环境中的免疫反应。首先，高密度的TIL是发挥较强的肿瘤免疫杀伤作用的保障。其次，免疫细胞要有效的识别肿瘤特异性抗原，解除免疫逃逸造成的肿瘤免疫抑制［29］。TNBC具有高度异质性，同一药物在不同患者、不同部位甚至同一肿瘤的不同区域的疗效存在很大差异。因此，有必要采用多模式联合治疗来增强抗肿瘤效应。

免疫检查点抑制剂在许多肿瘤类型中都取得了显著的临床疗效，但TNBC肿瘤微环境中T细胞浸润水平低，在免疫环境上属于“冷肿瘤”，因此临床疗效不理想［30］。溶瘤病毒具有募集TIL及增强肿瘤新抗原递呈引起的抗肿瘤免疫反应的特性，能使“冷肿瘤”变热，使其成为免疫检查点抑制剂理想的联合疗法。MOSTAFA等［31］通过EMT6小鼠原位乳腺癌模型发现，瘤内注射溶瘤呼肠孤病毒联合PD-1抑制剂相比单一疗法，显著改善了小鼠乳腺癌肿瘤负荷和总生存期。溶瘤病毒治疗还能改善免疫环境，显著增加CD4+和CD8+T细胞的在肿瘤局部的聚集和细胞因子的分泌。YANG等［32］在治疗4T1原位移植瘤小鼠的实验中发现，将构建好的靶向转化生长因子β的溶瘤病毒与抗PD-1和抗CTLA-4联合治疗可显著抑制肿瘤生长和肺转移，并且较单一疗法能显著提高疗效。溶瘤病毒治疗通过增加CD4+和CD8+T细胞的百分比以及促进脾抗原递呈树突状细胞的分化和成熟来激活肿瘤免疫，增强了抗PD-1与抗CTLA-4抗体对肿瘤生长和肺转移的抑制作用。

其次，溶瘤病毒治疗后可上调免疫检查点分子表达，是联合治疗的分子基础。BOURGEOISDAIGNEAULT等［33］首先在小鼠原位TNBC模型和二次移植瘤模型中发现，马拉巴（Maraba）病毒不仅对原位TNBC有强烈的抗肿瘤效应，还可预防复发；并发现全身静脉注射马拉巴病毒比瘤内注射更有效。马拉巴病毒不仅通过趋化因子有效地募集免疫细胞，更重要的是可上调4T1，EMT6和E0771 3种TNBC模型中乳腺癌细胞PD-L1的表达。以上结果提示，可通过PD-1抑制剂联合治疗以增强马拉巴病毒的疗效。研究者随后用相同的原位TNBC模型发现，马拉巴病毒联合PD-1抑制剂相比单一疗法，可显著减慢肿瘤生长速度（P<0.01）。联合疗法虽疗效显著但不能根除肿瘤。研究者将马拉巴病毒用于新辅助疗法与原发性肿瘤手术切除相结合，之后再应用PD-1抑制剂。结果表明，60%～90%模型动物可达到完全缓解。上述研究均表明，联合疗法比单一疗法的疗效更显著。

溶瘤病毒联合免疫检查点抑制剂疗法疗效显著，为TNBC患者带来新希望，也为后续的临床试验提供了理论基础。

4 结语

TNBC的治疗是乳腺癌治疗中的一大难题。溶瘤病毒与免疫检查点抑制剂这种相辅相成的联合治疗手段为TNBC患者带来曙光。然而，目前大多数研究仍处于基础研究阶段。药物的注射途径、联合用药的治疗顺序与剂量及最适对象的选择等都需要进一步的合理设计。除此之外，病毒的选择与制备工艺，免疫检查点的表达状态，预测疗效的生物标志物等均需进一步研究。随着肿瘤免疫学的进步，溶瘤病毒联合免疫检查点抑制剂在TNBC的治疗中将会有更广阔的前景。