一例牛急性感染伪狂犬病病毒的分离鉴定

郭广君， 韩 强， 刘吉山1，*， 吕素芳， 姚春阳1，， 沈志强

(1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东省兽医生物技术重点实验室，山东 滨州256600；2.山东省滨州畜禽蜂胶疫苗研究开发推广中心，山东 滨州256600；3.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600)

牛伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)引起牛的以发热、奇痒、脑脊髓炎为主要特征的急性传染病，临床症状主要表现为腹泻、呕吐、生长不良[1]。PRV宿主范围很广，可感染猪、牛、羊等多种家畜和野生动物，是一种极为重要的急性传染病病原[2]。在我国，1947年在猫发现首例伪狂犬病。近年，陆续有猪、牛、羊、貂、狐、鹿、驴、骡等感染该病原的报道[3]。伪狂犬病毒是疱疹病毒科中抵抗力较强的一种，在37 ℃下的半衰期为7 h，8 ℃可存活46 d，而在25 ℃干草、树枝、食物上可存活10～30 d，但短期保存病毒时，4 ℃较-15 ℃和-20 ℃冻结保存更好。病毒在pH 4.0～9.0之间保持稳定。5.0%石炭酸经2.0 min灭活，但0.5%石炭酸处理32 d后仍具有感染性。0.5%～1.0%氢氧化钠迅速使其灭活。对乙醚、氯仿等脂溶剂以及福尔马林和紫外线照射敏感。

2017年4—9月份，山东东营地区几家牛场的牛陆续发生发热、流涎、眼睑肿大、流泪、用力呼吸、脑水肿等症状，个别牛表现出瘙痒症状。犊牛临床表现为烦躁不安，鸣叫，流涎，眼睑肿大，流泪等；青年牛和母牛表现温和，出现厌食，喜卧，眼睑肿大，流泪等症状；犊牛发病后24～72 h内死亡，青年牛和母牛病程在10 d以上，经干预治疗，恢复正常。其中1户发病牛13头，死亡3头。病牛和死牛出现类似临床症状，经实验室诊断，确诊是由PRV感染所致。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 样品 无菌采集鼻腔液试子及脑组织。

1.1.2 试剂 组织病毒基因组DNA提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；转染试剂Lipsome regent 2000购自Invitrogen公司。PMD18-T，Primix TaqTM(LA TaqTMVersion2.0)购自宝生物工程(大连)有限公司，其他化学试剂均为化学分析纯。

1.1.3 细胞 乳仓鼠肾(BHK-21)细胞系、猪伪狂犬病病毒SA株均由山东省滨州畜牧兽医研究院实验室保存。

1.1.4 引物 根据已发表的PRVgB基因序列，设计引物，由上海生工生物工程公司合成。gBF：5′-CGCGGATCCATGGCGGCCGTGACGCGGGCCGCCTCGGCCT-3′；gBR：5′-ACGCGTCGACCTAGCTCCACCTGCTGGAAGCGCCCGGG-3′。

1.2 方 法

1.2.1 病料采集 采集病牛鼻腔液试子及脑组织，-40 ℃保存备用。

1.2.2 病毒基因组的提取 取病牛的脑组织用无菌生理盐水充分研磨，并反复冻融3次，5 000 r/min离心5 min收集上清液，按照组织病毒基因组DNA提取试剂盒说明提取病毒DNA。-20 ℃保存备用。

1.2.3 BHK-21细胞的培养 采用脂质体法转染BHK-21细胞。细胞培养：取6孔培养板，向每孔中加入2.0 mL含1.0×105个细胞的培养液，37 ℃ CO2培养12.0 h。

1.2.4 病毒基因组感作BHK-21细胞 在EP管中制备以下溶液：A液，用不含血清培养基稀释2.0 μg病毒基因组DNA，体积为100.0 μL；B液，用不含血清培养基稀释10.0 μL脂质体(Lipfectim regent 2000)，终量100.0 μL，轻轻混合A、B液，室温中放置20 min，期间混匀2次。

用2.0 mL不含血清培养液漂洗六孔板细胞2次，再加入1.0 mL不含血清培养液。转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37 ℃温箱感作2 h，吸除无血清转染液，加入2.0 mL 6.0%血清细胞生长培养液12 h，第2天更换培养液,2.0%血清细胞维持培养液继续培养,观察病变情况。接种PRV作为对照，正常细胞做阴性对照。

1.2.5 病毒半数细胞感染量(TCID50)测定 将病毒培养液作连续10倍稀释，即10-1，10-2，…，10-10。每个稀释度取100.0 μL加入铺有BHK-21细胞96孔细胞培养板中，每个稀释度设8个重复，并设空白细胞培养对照,置37 ℃的5.0% CO2培养箱中,逐日观察细胞病变，并记录细胞病变孔数(CPE)，用Reed-Muench法计算病毒的TCID50。

距离比例=(高于50.0%病变率百分数-50.0%)/(高于50.0%病变率百分数-低于50.0%病变率的百分数)

lg(TCID50)=X=距离比例×稀释度对数之间差+ 高于50.0%病变率稀释度的对数

TCID50=10X/0.1 mL

1.2.6 PCR鉴定 PCR反应体系(10.0 μL体系)：DNA模板1.0 μL，gBF 0.5 μL，gBR 0.5 μL，Primix TaqTM(LA TaqTMVersion2.0) 5.0 μL，ddH2O 3.0 μL。PCR扩增程序：96 ℃预变性5 min；98 ℃ 10 s，68 ℃ 2 min，40个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物电泳、克隆和序列测定。PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，用Omega公司胶回收试剂盒回收PCR产物。目的片段克隆到pMD18-T，经PCR鉴定阳性的重组质粒送宝生物工程(大连)有限公司测序。

2 结果与分析

2.1 DNA提取结果

取牛鼻腔液试子及脑组织，以组织病毒基因组DNA提取试剂盒提取DNA，显示大小在15 000 bp左右，结果如图1。

注：泳道M为DL 15 000 Marker；数字1为阴性对照；数字2为鼻腔试子提取病毒基因组DNA；数字3为脑组织提取病毒基因组DNA。

图1DNA提取结果

2.2 细胞病变结果

转染48 h后，引起细胞明显病变，与正常细胞相比可见病变细胞肿胀，变圆，出现颗粒，失去光泽，萎缩，脱落，拉网等现象(图2a)。与接种PRV细胞病变结果相符(图2b)，正常细胞无病变(图2c)。

(a)病料DNA病毒基因组引起的 BHK-21细胞病变(200×) (b)PRV SA strain引起的 BHK-21细胞病变(200×) (c)BHK-21正常细胞对照(200×)

图2细胞病变结果

2.3 TCID50计算

用Reed-Muench方法计算TCID50，结果如表1所示。经计算，TCID50=10-4.8/0.1 mL，即将该病毒稀释104.8接种100.0 μL可使50.0%的细胞病变。

表1 TCID50结果

2.4 PCR扩增及测序结果

用gBF/gBR引物以鼻腔液和脑组织提取DNA为模板进行PCR检测，结果显示在1 300 bp左右有目的条带，与预期结果相符，结果如图3。

注：泳道M为DL2000Marker；数字1为阴性对照；数字2为阳性对照；数字3为鼻腔液提取DNA PCR；数字4为脑组织提取DNA PCR。

图3PCR结果

2.5 测序结果及分析

测序得到病毒gB基因部分序列，NCBI登录号：KX147097，827 bp，编码260个氨基酸。进化树分析表明，该毒株与中国分离株SC株在同一个相对独立的分支中(图4)，与其他毒株氨基酸序列同源性在94.0%～100.0%，且与国内株的同源性高于国外株的同源性。该氨基酸序列与SC株有1个氨基酸的差异，在此片段第193位，由SC株色氨酸突变为精氨酸。

图4 gB基因进化树

3 讨 论

牛伪狂犬病是由疱疹病毒Ⅰ型引起的以发热、奇痒及脑脊髓炎等为主要症状的牛急性致死性传染病[4]。近年来，牛伪狂犬病屡有发生。如汤明等[5]2002年在实验室诊断役牛猝死为伪狂犬病毒所致，曾宪勇等[6]2005年鉴定到3头发病牛，袁凤燕等[7]2009年发现20头发病小黄牛。牛伪狂犬病虽然呈散发流行，但是由于目前没有特效治疗方法，病死率几乎为100%，给养牛业造成很大的经济损失，所以加强对牛伪狂犬病的防制尤为重要[8-10]。

本试验取病牛鼻腔试子，提取病毒基因组DNA，通过PCR扩增检测，得到了特异性核酸片段，经基因测序和实验室血清学诊断，鉴定为伪狂犬病病毒。本次肉牛发生伪狂犬疾病，经调查，该牛场上风口为猪场，曾爆发伪狂犬病，通过饲养员交叉污染带入牛养殖场。由于该病发现及时，对未发病牛群及时隔离饲养，并对整个牛群采取消毒、治疗等措施，将损失减少到最低，通过近1年来跟踪调查，发病牛场及周边平稳，未发生相关疫情。伪狂犬病病毒可以通过空气传播，如猪发病或猪带毒，牛吸入含病毒粒子的空气就会感染伪狂犬病病毒而发病。建议如发现牛感染伪狂犬病，要对患病牛进行隔离防治处理，并对同群牛进行紧急预防接种疫苗，对场地及养殖设施进行消毒，对同群牛隔离观察，把损失降至最小和尽早控制扑灭疫情。