生物样品中儿茶酚胺的分析方法研究进展*

周 慧，董 佳，贺茂芳,2**，刘文杰，程清轩，何孝文

(1.西安医学院 药学院，陕西 西安 710021；2.西安医学院 药物研究所，陕西 西安 710021)

儿茶酚胺(Catecholamines，CAs)类物质主要包括去甲肾上腺素(Norepinephrine，NE)、5-羟色胺(5-Hydroxytryptamine，5-HT)、肾上腺素(Epinephrine，E)和多巴胺(Dopamine，DA)[1]。CAs既是神经传导介质，也是内分泌激素，在生物体内发挥重要的生理功能。临床上，可通过检测人体中血浆或尿液中CAs的浓度水平用于诊断高血压、糖尿病、甲状腺功能异常等内分泌相关的疾病[2-3]。因此，建立选择性好、灵敏度高、快速准确的分析方法具有重要意义。目前，测定CAs的方法有高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳法(CE)、电化学法和荧光光度法(FL)等。作者就近年来CAs的测定方法进行了评述，将为发展CAs的检测新方法提供参考依据。

1 HPLC法

HPLC法由于具有方便、快速、准确等优点，是CAs最常用的分析方法。由于CAs分子中的氢键易于和硅醇基形成氢键，从而造成不可逆吸附，因此通常向流动相中加入酸改善峰型；或者向流动相中加入离子对试剂，如十八烷基磺酸钠，采用离子对色谱进行分离。HPLC法常与电化学检测器(ECD)、荧光检测器(FLD)、质谱(MS)等联用，以提高灵敏度[4]，ECD因其高灵敏度、高分离效率成为首选。

1.1 HPLC-ECD

李静娜等[5]建立了HPLC-ECD法测定人体血清中的CAs，首先采用氧化铝作为固相萃取材料对CAs进行预富集，再运用HPLC-ECD检测，获得最低检出限为0.1 ng/mL。该方法操作简单，所需生物样本少，同时，还具有灵敏度高、回收率和重现性良好的优点。

于梦洋等[6]应用HPLC-ECD检测大鼠血清中的E、NE以及DA的含量，研究了束缚挤压伤大鼠血清中CAs的变化。结果显示，E、NE及DA的分离效果良好，无内源性杂质的干扰，各物质的回收率分别为98.54%、99.21%和97.31%。

张文等[7]以掺铈纳米二氧化铅修饰电极作为HPLC的检测器，建立了人体脑脊液中DA等单胺类神经递质及其代谢产物的测定方法。该修饰电极具有良好的电催化作用，获得了较高的灵敏度和良好的重现性。

曾文芳等[8]采用离子色谱分离、碳纳米管修饰电极检测，以c(硫酸)=10 mmol/L-φ(乙腈)=10%溶液为流动相测定CAs。该方法的检出限为0.04～0.09 ng/mL，回收率为96%～102%，具有准确度高、精密度好的特点，是一种简单快速的分析方法。

吴朝阳[9]等人为减少血浆用量、提高实验稳定性，采用弱阳离子固相萃取小柱联合HPLC-ECD法提取并检测人体血浆中的CAs。该方法的结果准确可靠、灵敏度好、操作简便，适合于临床诊疗的需要。

Tolmacheva等[10]采用超交联聚苯乙烯进行预富集，联合HPLC-FLD法检测CAs，优化了NE、DA和E的预富集条件为微柱(10 mm×6 mm)、吸附剂质量0.03 g、溶液体积25 mL(pH≈8.5)，溶液透过率1.0 mL/min。将该方法应用于尿液中CAs的分析检测，准确性高、重现性好。

1.2 HPLC-FLD

邓祖跃等[11]采用HPLC-FLD法测定了不同脑区CAs及其代谢产物的含量，作者优化色谱条件，建立了新的梯度洗脱系统，既可以检测常见的3种CAs，也可以检测其对应的代谢物。该方法简便准确、分离度高、重复性好，适用于一般实验室脑组织中CAs及其代谢产物的测定。

张璐璐等[12]采用HPLC-FLD法研究了小鼠脑皮层、丘脑等不同部位的单胺类神经递质及其相关物质。样本经高氯酸沉淀蛋白后进行色谱分析，7种目标物在45 min内完全分离，并且样本基质无干扰。该方法鉴别出小鼠脑中存在NE、DA和E等物质，结果准确，同时提取回收率大于90%。

乔坤云等[13]采用HPLC-FLD法检测CAs，可同时分离测定NE、DA和E 3种组分。该方法的前处理简单易操作，同时也具有较高的灵敏度和稳定性。

1.3 HPLC-MS

HPLC-MS法能够高效、高灵敏度分离和检测待测物质，但为了提高分析结果的准确度和选择性，通常需要复杂的样品前处理过程[14]。

郭玲等[15]利用HPLC-MS法对大鼠血浆中的DA、E以及NE等7种神经递质进行了快速有效检测。首先采用Waters XSelect@HSS PFP色谱柱进行分离，然后以乙腈-φ(甲酸)=0.1%和水-φ(甲酸)=0.1%溶液为流动相进行梯度洗脱。通过优化质谱条件，避免了假阳性结果，提高了方法的准确度。

丘秀珍等[16]运用DA作为模板，多孔的阳极氧化铝膜为反应载体，合成了DA印迹聚合物纳米管膜，通过HPLC法研究了其对CAs的吸附性能。结果显示，在最优萃取条件下，DA印迹聚合物纳米管膜对NE、DA和E均具有较好的选择性，该方法能快速、准确的检测出人尿液中CAs的含量。

亓伟梅等[17]通过建立超高液相色谱(UHPLC)-MS/MS法，实现了微量大鼠脑微透析液中3种CAs的高灵敏检测。该方法可以快速、准确地检测出3种组分，能够满足大鼠脑微透析液中CAs的检测要求，具有一定的检测优势。

黄鑫等[18]采用HPLC-MS法检测大鼠和海马大脑皮层中生物胺及氨基酸类神经化学物质的含量，比较了不同脑组织样品前处理方法对测定结果的影响，实验结果灵敏度高、专属性强，可为CAs提供有效的样品前处理方法和检测手段。

2 电化学法

CAs在电极表面呈现不同的电化学行为，因而具有不同的氧化峰电流和电极电位，从而可使用电化学法对其进行检测。现阶段，电化学法检测CAs的主要方法为化学修饰电极法，该方法将聚合物膜修饰在电极表面从而提高电极电催化性能。邓克勤等[19]通过电聚合法制备了硫堇膜修饰电极，研究了CAs在该电极上的电化学行为，与裸玻碳电极相比，氢化峰电流增大且峰电位负移至165 mV。该电极的重现性较好，实现了对CAs和氢醌的同时测定。R Ramaraj研究小组[20]采用聚吖嗪和聚酚藏花红膜玻碳修饰电极，同时测定了DA和抗坏血酸，其线性范围分别为5.0×10-5～5.0×10-4mol/L和5.0×10-5～1.0×10-3mol/L。Yi等[21]首次报道了聚乙烯醇缩丁醛/氧化石墨烯(PVB/GO)纳米复合膜电化学传感器用于CAs代谢产物的同时测定。PVB/GO修饰玻碳电极对高香草酸和香草醛扁桃酸的氧化具有良好的亲和性和电催化活性，差分脉冲伏安法显示这2种代谢物在修饰电极上的峰电位几乎一致。研究者从线性范围、精密度、稳定性、重复性和回收率等方面对传感器的性能进行了评价，证明该传感器具有成本低、稳定性好、灵敏度高的优点。

为了提高分析的选择性，Kajisa等[22]以DA为模板，在场效应晶体管(FET)生物传感器的Au栅电极上合成了分子印迹聚合物(MIP)，该电极在40 nmol/L～20 μmol/L对DA有显著的响应，而非印迹聚合物涂层的FET栅极表面电位几乎没有变化，证实了DA-MIP涂层FET传感器对DA的选择性和定量检测。

纳米材料具有特殊的物理性能、优异的光电化学性质，将纳米材料用于电极的表面修饰能有效提高电极的催化性能，提高选择性和灵敏度。例如，谢云峰等[23]将羧基化多壁碳纳米管(MWNTs)修饰在玻碳电极表面，用于DA和5-HT的研究，发现羧基化MWNTs修饰电极对DA和5-HT具有显著的电催化作用，可用于这2种物质的同时测定。

3 CE法

CE是一种高效的分离技术，在药物分析、体液成分的分离与分析等方面具有广泛的应用，具有样品用量少、成本低廉等优点。CE法依据待分离物质的电荷性质进行分离，由于分析物易于和毛细管壁作用，所以通常需要对毛细管进行修饰，从而实现基线分离，确保重现性。CE通常与化学发光法(CL)、MS、紫外检测器(UV)等联用，用于CAs的检测。

3.1 CE-CL法

张东明等[24]建立了用半导体激光诱导荧光结合CE测定NE和DA的分析方法，考察了青色素衍生物(Cy5)对NE和DA的各种衍生条件。在优化条件下，NE和DA在3×10-8～5×10-6mol/L内与其荧光强度呈线性关系。NE和DA的最低检测浓度分别为5.9×10-9、5.4×10-9mol/L。该方法的优点是简便、灵敏、样品用量少，适合于痕量单胺类神经递质的分析。

徐向东等[25]基于碱性介质中CAs对鲁米诺-Ag(Ⅲ)化学发光体系有增敏作用的原理，建立了CE-CL法检测DA、E与NE的新方法。在优化的电泳和化学发光条件下，DA、E与NE可获得良好分离，其检出限(S/N=3)分别为10、100、200 ng/mL。

李欣欣等[26]基于碱性条件下CAs淬灭铁氰化钾-鲁米诺发光的原理，建立了CE-CL技术分离测定3种CAs的方法。在最佳条件下，测得DA、E、NE的检出限分别为50.49、329.76、406.03 ng/mL。该方法采用的间接化学发光法是基于酚类物质与铁氰化钾之间的氧化还原原理，因此，生物样品中的蛋白质、氨基酸及糖类等无还原性的物质不会产生信号，从而大大提高了选择性。

3.2 CE-MS

王贤亲等[27]采用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18柱，以乙腈-φ(甲酸)=0.1%溶液为流动相，电喷雾离子源(ESI)正离子模式，采用多反应监测方式对样本进行定量分析。结果显示，E、NE和DA的检出限分别为4.3、2.4和6.6 ng/mL，线性范围为10～500 ng/mL，平均回收率为85.8%～93.4%。该方法的专属性强、灵敏好、准确高，适用于人血浆CAs的快速检测。

3.3 CE-紫外光谱法(UV)

付敏等[28]建立了高效毛细管电泳结合UV检测DA和5-HT的方法，在优化的实验条件下，DA、3,4-二羟苄胺和5-HT在10 min内得到很好的分离，检出限分别为3.09×103、1.42×103、2.11×103ng/mL，该法简便快速、样品用量少、结果准确、重现性好。

3.4 其他

张丽瑶等[29]研究了毛细管预处理方法对组胺、5-HT及CAs电泳分离的影响，采用优化的毛细管预处理方法及电泳分离条件，基线分离了组胺、5-HT、NE和E。利用DA和5-HT在毛细管内壁吸附效应的不同，对电泳淌度极为相近的DA和5-HT进行了分离和鉴定。以小鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞为研究对象，证实了该细胞中所含大量神经递质为DA，而不是5-HT。

林玲等[30]基于CE法建立了儿茶酚及DA的主要代谢产物二羟苯乙酸(DopAC)的定量分析，灵敏度可达5×10-9g/mL，线性范围为0.01～0.32 μg/mL。该方法用于儿茶酚和DopAC的分析具有快速、简便、耗材少的优点。

高萍等[31]采用CE法检测了46例正常人以及11例嗜铬细胞瘤患者尿中NE、间甲肾上腺素(MN)、间去甲肾上腺素(NMN)和3-甲氧基-4-羟基苦杏仁酸(VMA)的含量。结果显示，NMN和MN联合检测的阳性率为100%，假阳性率为19.56%。因此，CE法对NMN和MN联合检测对于诊断嗜铬细胞瘤有意义。

4 光谱法

光谱法是基于物质与辐射能作用时，物质内部发生量子化能级跃迁而产生发射、吸收或散射的波长和强度进行分析的方法。

4.1 荧光法

胡红美等[32]提出了用芯片电泳分离-激光诱导荧光光谱法测定CAs的方法。采用自制的无泵负压进样系统，避免了进样歧视效应。在优化的条件下，NE、DA和E可在1 min内完全分离。3种CAs的平均迁移时间依次为30.59、37.23、46.43 s，相对标准偏差(n=7)依次为1.10%、1.28%、0.45%，线性范围为0.3～5.0 mg/L(NE及DA)和0.05～4.0 mg/L(E)，检出限依次为30、30、10 ng/mL。

Nikolajsen等[33]利用E和NE光谱之间的差异，通过铁氰化钾氧化CAs生成相应的三羟基吲哚类物质，利用硫酸锌为催化剂，抗坏血酸为稳定剂来提高其荧光强度，所得数据用两组分四列并行因子分析模型同步测定E和NE，检测灵敏度可达7.5×10-8mol/L。

赵燕燕等[34]将胶束增敏与同步荧光-双波长法用于血浆样品中CAs的同时测定，取得了良好的结果。发射波长(λem)在370.0～550.0 nm，激发波长(λex)和λem的波长差为70.0 nm的条件下分别进行扫描，获得同步荧光光谱图，在385.0 nm处直接读出DA的荧光强度。

Palop等[35]报道了利用水中的溶解O2氧化E，在碱性条件下最终形成肾上腺素黄，然后通过流动注射-FL法检测450 nm处的吸收峰，结果显示，对E检测的线性范围为0.5～20 μg/mL，检出限为2.0×102ng/mL。

4.2 分光光度法

Nagaraja等[36]报道了重氮硝基苯胺(DPNA)在酸性条件下与CAs的衍生物反应，所产生的红色复合物在500～510 nm处有强吸收峰，由此得出E的检出限为1.47×102ng/mL。

Teixeira等[37]用固定在聚酯树脂上的PbO2作为固相反应器氧化E得到的肾上腺素红，然后在486 nm处用流动注射分光光度法检测吸收峰，结果显示E在1×10-4～8×10-4mol/L内有良好的线性关系，检出限为1.47×103ng/mL。

Abdulrahman等[38]用p-甲苯胺在高碘酸钠的氧化作用下和E形成橙色的可溶性产物，该产物在480 nm处有最大吸收峰，可用流注射分光光度法检测，检测下限为6.78×102ng/mL，线性范围为2.7×10-5～3.7×10-4mol/L。

5 结束语

CAs作为生物体内重要的神经传导介质，对其进行准确、快速和同时检测具有重要意义。目前，CAs的检测方法有很多，各有优势，相互补充，为CAs的检测提供了多种途径。其中，HPLC、EC和电化学法是最有效的方法，具有较好的实际应用价值，为生物样品中CAs的准确测定奠定了基础。