化学发光免疫分析技术在动物疫病检测中的应用

（漯河市动物疫病预防控制中心，河南漯河 462000）

化学发光免疫分析（chemiluminesecence immunoassay，CLIA）是基于免疫反应原理，结合化学发光检测技术而建立的一种免疫检测技术。它是继放射免疫技术（RIA）、免疫荧光技术（IF）、酶免疫技术（EIA）之后发展起来的。与RIA、EIA等相比，CLIA 除具有灵敏度高和特异性强的优势外，还具有无放射性污染、检测线性范围宽、检测效率高、操作简便的特点，目前已被广泛应用于生命科学、医学诊断、食品安全以及环境监测等领域[1]，是发展和推广应用最快的标记免疫分析技术之一。近年来，CLIA 技术开始引入动物疫病检测领域，其在灵敏度、稳定性和检测效率上明显优于酶联免疫吸附测定方法（ELISA），且可实现高通量和自动化检测，已在H9 亚型禽流感、鸭甲型肝炎、猪细小病毒病、猪繁殖与呼吸综合征、O 型口蹄疫、小反刍兽疫、布鲁氏菌病等疫病检测中得到了应用。本文阐述了CLIA 技术的原理、发展及在动物疫病检测领域中的应用，以期为动物疫病化学发光免疫检测方法研究提供参考。

1 CLIA 技术原理

CLIA 是将化学发光作为免疫反应的指示系统，用化学发光相关物质标记抗体或抗原，与待测物质发生特异性反应后，再加入其他相关物质使发光物发光，从而根据光信号强度来确定待测物质浓度的方法。CLIA 技术包括化学发光检测技术和免疫反应，其中免疫反应是基础。免疫反应是指在一定条件下，抗原与相对应的抗体结合形成抗原-抗体复合物的特异性反应。化学发光本质是一种光辐射，是伴随化学反应而产生的。化学发光剂分子通过吸收化学反应过程产生的能量，从基态跃迁到激发态，当处在较高能级激发态的分子重新跃迁到较低能级的基态时，会释放等能级的光子，从而产生化学发光。化学发光的光信号强度可以由仪器检测。在一定的化学反应中，发光强度与反应体系中物质浓度正相关，因此可以在一定的化学反应环境条件下，通过化学发光强度来测定待测物浓度。

在目前的CLIA 方法中，有两种主要标记方法：一是用化学发光剂直接标记抗原或抗体，在一定条件下反应，使发光剂产生化学发光从而进行物质测定分析。常用的发光剂有鲁米诺类和吖啶酯类，其经氧化剂或催化剂作用后即可快速稳定发光，产生的光量子强度与所测抗体或抗原浓度呈比例。二是用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶类标记抗原或抗体，即化学发光酶免疫分析方法。它是在酶联免疫分析的基础上，用化学发光剂作为底物，在酶的作用下产生化学发光，根据发光强度来测定待检物质浓度。还有一种是电化学发光免疫分析（ECLI）方法。不同于前两者，它是在电极表面由电化学引发特异性发光反应，以电子得失过程中的电位差作为能量激发源的免疫分析方法，一般采用三联吡啶钌[Ru（bpy）3]2+为标记物，由电化学反应启动。

2 CLIA 技术发展

1977 年，Halmann等[2]首先提出CLIA 技术。早期的CLIA 技术虽然有较强的特异性，但因光信号持续时间太短、灵敏度不高，未广泛应用于临床检测。20 世纪80—90 年代，国外学者研究发现：在辣根过氧化物酶催化的鲁米诺发光反应中，加入6-羟基苯并噻唑及其衍生物类或对位取代的苯酚类化合物等物质后，可以显著增强HPR-Luminol-H2O2体系的发光信号强度，延长化学发光持续时间[3-4]；而且，用吖啶酯衍生物直接标记抗体或抗原可以产生较高的光信号，金刚烷衍生物在碱性磷酸酶作用下也可发出高强度的辉光，光信号可持续l～2 h[5-6]。随后，国外生产厂家研制开发出相应试剂盒和全自动CLIA 系统，自此CLIA 技术开始被广泛应用于临床检测。1990 年，Leland等[7]建立了电化学发光反应系统，大大提高了化学发光免疫检测的灵敏度，稳定性、检测效率和线性范围。

近年来，随着一些新材料、新技术的发展成熟，特别是金纳米粒子、SiO2纳米粒子、碳纳米管、量子点以及它们的复合纳米结构在高灵敏CLIA 检测方法构建中的广泛应用，化学发光免疫分析取得了突破性进展。首先在灵敏度上，通过研究新的化学发光剂、催化剂、增强剂及固相材料，优化化学反应条件，用小蛋白封闭生物功能界面，筛选制备高特异性抗原和单克隆抗体，修饰ECLI 中的电极表面，转移化学发光共振能量等手段，使CLIA 方法发光信号强度和稳定性大大增强，灵敏度和特异性大大提高。其次，化学发光免疫分析与流动注射、毛细管电泳、微阵列芯片及免疫传感器等先进技术的联用，实现了高分离能力、高通量、自动化、快速、高效和多组分检测，促进了化学发光技术的快速发展，也拓宽了其应用范围。

3 CLIA 技术在动物疫病检测中的应用

随着各国对CLIA 技术研究的不断深入，其已应用到了许多动物疫病的临床检测中。欧盟已经将CLIA 方法作为牛海绵状脑病（BSE）的快速检测手段之一，并准备推广为小反刍动物疫病，如绵羊痒病（TSE）等的快速检测手段[8]。

3.1 病毒检测

2015 年，亓文宝等[9]成功建立了H9 亚型禽流感病毒抗体ECLI 方法。此方法具有高度特异性，与其他亚型病毒无干扰，且能够实现快速、高通量检测，具备临床推广条件。郑小龙等[10]建立了检测血清中鸭黄病毒抗体的CLIA 方法。该方法特异性强、敏感性高，与鸭瘟、鸭病毒性肝炎和禽流感病毒抗体无交叉反应，最低可检测出1:6 400 稀释血清中的鸭黄病毒抗体，灵敏度为中和试验的56 倍，适用于流行病学调查及监测。银凤桂等[11]2017 年研究建立了一种快速、灵敏、特异、重复性好的化学发光酶免疫检测方法（CLEIA），适合鸭甲型肝炎的批量检测诊断，检出限低至1:0.289～1:1.5，也可用于鸭甲型肝炎免疫后的抗体监测以及雏鸭体内母源抗体的定量分析。

Zhang等[12]通过用羟氨放大金纳米颗粒反应来增强化学发光信号，建立了超灵敏、简便、快速、特异性强、重复性好的猪圆环病毒2 型化学发光检测方法。Zhou等[13]将HRP 和检测抗体同时固定在金纳米粒子表面，形成金纳米粒子探针，建立了一种快速、简便、灵敏的检测猪细小病毒抗体的CLIA 方法。该方法检测限远低于ELISA 方法。Yang等[14]基于磁性纳米颗粒建立了高效检测伪狂犬病毒的CLIA 检测方法，其最低检测限为100 amol/（5 pmol/L）。张社民等[15]将化学发光检测系统和ELISA 相结合，建立了猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测新方法，并成功制备出了试剂盒供临床应用。

2017 年，邵康等[16]以金-石墨烯纳米复合材料为电活性基质，硅包联吡啶钌纳米粒子为电化学发光信号标签，利用生物素-链霉亲和素-生物素构建了三重和多重信号放大的检测猪伪狂犬病毒抗体的电化学发光免疫传感器，检测范围为50 ng/mL～1 pg/mL，最低检测限可达到0.40 pg/mL，与ELISA 和荧光测定分析方法相比，灵敏度更高，检测线性范围更宽，重现性和稳定性更好。同时利用碳纳米管作为量子点载体，通过多孔铂金纳米管的催化作用和β-环糊精与金刚烷“桥”作用，采用“抗体-抗原-抗体”双抗体夹心模式，构建了信号放大的近红外电化学发光传感器，实现了对猪繁殖与呼吸综合征病毒的高灵敏检测。在19 ng/mL～19 pg/mL 范围内，电化学发光信号强度与猪繁殖与呼吸综合征病毒浓度呈线性相关（R2=0.9 951），最低检出限为10.8 pg/mL，与ELISA 和PCR 方法相比具有更高的灵敏度和更宽的线性检测范围。

2016 年，崔辰等[17]利用猪O 型口蹄疫病毒VP1 重组蛋白为包被抗原，成功建立了一种快速检测猪O 型口蹄疫病毒抗体的CLEIA 检测方法，较传统的ELISA 法，其敏感性和精密度都大大提高，与猪A 型、Asia 1 型口蹄疫病毒以及猪伪狂犬病、猪瘟、猪细小病毒病、猪圆环病等病原均无交叉反应，板内和板间变异系数分别为1.10%～6.70%和0.66%～4.80%，具有较好的特异性和重复性，可用于猪O 型口蹄疫病毒抗体检测。2018 年，王世杰等[18]建立了一种高效O 型口蹄疫高通量LPBCLIA 定性检测方法，用单一稀释倍数对样本血清进行稀释，代替LB-ELISA 中对样本的倍比稀释，通过计算抑制率来判定测定结果，使检测通量提高了5 倍左右，同时用化学发光检测技术替代酶免检测技术，提高了方法的灵敏度和稳定性。重复性试验结果显示，该方法检测结果稳定，具有很好的可重复性。通过临床样品检测发现，与国家参考实验室兰州兽医研究所O 型口蹄疫抗体LPB-ELISA 检测试剂盒相比，该方法敏感性为94.6%，特异性为95.6%，符合率为95.1%，证明其具有良好的敏感性和特异性，可大大提高检测效率和材料利用率，为猪O 型口蹄疫检测提供了更为高效、经济的新方法。2018 年，Liu等[19]建立了检测口蹄疫病毒3A 和3B 中两种重组表位蛋白抗体的CLIA 方法，能够准确区分口蹄疫病毒感染抗体和疫苗免疫抗体，有效解决了非结构蛋白（NSPs）对灭活疫苗污染而导致较高的假阳性率问题。

2019 年，任雪健等[20]建立了小反刍兽疫病毒抗体化学发光酶免疫分析检测方法，用鲁米诺作为发光底物代替传统的TMB 底物，提高了检测的敏感性、稳定性。通过临床样本测定发现，该方法与法国ID-VET 试剂盒的阳性和阴性符合率均大于95%，且与羊O 型口蹄疫病毒、绵羊痘病毒和山羊痘病毒等羊常见病毒无交叉反应，可用于小反刍兽疫病毒感染或疫苗免疫抗体水平检测。

3.2 细菌检测

目前，CLIA 技术在细菌检测上的应用主要集中于人兽共患病检测方面。Hu等[21]报道了一种基于AuCl4-增强型鲁米诺CLIA 检测方法。该方法能够特异性测定血清中的猪传染性胸膜肺炎Apx Ⅳ抗体，与IHA、ELISA等常规检测方法相比，在灵敏度和实用性方面具有显著优势，适用于大规模血清样品的筛选。Mutz等[22]将CLIA 技术与流动注射技术、免疫芯片技术结合起来，建立了检测戊型肝炎病（HEV）和肠源性耶尔森氏菌抗体的CLIA 方法，实现了快速、高通量、自动化的检测分析。这种方法可在9 min 内完成检测，能够灵敏、特异地同时检测血清中HEV和抗耶尔森菌IgG抗体。Morel等[23]建立了检测炭疽杆菌的ECLI 法，检出限为3×102CFU/mL，灵敏度较高。Liebes等[24]设计了化学发光免疫传感器用于检测抗布鲁氏菌抗体。该方法采用光纤作为换能器，将布鲁氏菌颗粒固定到光纤上，检测限可低至0.207 µg/mL；较ELISA 耗时少，操作简单，适合布鲁氏菌病现场诊断。Vidziunaite等[25]经长期研究，建立了一种检测布鲁氏菌病和兔土拉杆菌病的高灵敏度增强型CLIA 方法，其检测线性范围较传统方法有了较大提高。2016 年，Fei[26]等建立了一种基于纳米颗粒的检测白痢沙门氏菌的夹心电化学免疫分析方法。该方法用金纳米粒子修饰还原氧化石墨烯作为电化学标记，用抗鸡白痢沙门氏菌抗体与二氧化硅包被的磁性纳米粒（SiO2/Fe3O4）来识别目标沙门氏菌，在102～106CFU/mL 范围内呈良好的线性关系，检测限低至89 CFU/mL，具有成本低、操作简便等优点，为临床分析提供了一种有效的检测方法。

在国内，房芳等[27]研究建立了一种可同时检测3 种沙门氏菌（猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌）的间接CLEIA 检测方法。此方法简便、快速，具有良好的特异性，与其他3 种常见肠道致病菌无交叉反应，检测限为1×104CFU/mL，检测准确率可高达97.33%。2017 年，范龙兴等[28]将CLIA 技术与磁分离技术、夹心法 ELISA 相结合，建立了检测单核细胞增生性李斯特菌的化学发光磁酶免疫分析方法。该方法在104～108CFU/mL 范围内呈良好的线性关系（R2=0.954），最低检出限为104CFU/mL，特异性良好，对检测环境要求不高，操作简单，检测时限仅为3～4 h，适用于单增李斯特菌的快速检测。2019 年，辛思培等[29]建立了针对肠出血性大肠杆菌O157:H7 的双抗夹心CLEIA 检测方法。该方法最低检测限为2.5×104CFU/mL，比ELISA 方法提高了4 倍左右，具有良好的特异性，与其他大肠杆菌、副溶血弧菌、沙门氏菌、阪崎肠杆菌、单增李斯特菌、铜绿假单胞菌等致病菌均无交叉反应。在精密度方面，批内和批间变异系数分别为2.10%～3.71%和2.16%～7.14%，证明其有良好的精密度，为O157:H7 污染检测提供了一种准确度高、特异性强的检测手段。

3.3 寄生虫检测

青宪等[30]采用磁性纳米颗粒作为免疫反应载体，建立了一种用于检测兔血清中日本血吸虫抗体的CLEIA 方法。该方法检测下限为1:13 442，灵敏度高，线性范围宽，特异性好。Singh[31]分别采用ELISA 和液相化学发光酶免疫分析方法，检测已知感染弓形虫的猪和猫血液病料，发现后者的检测灵敏度远高于前者，而前者不能灵敏地测出猫血液样本中的弓形虫抗体含量。目前化学发光免疫分析法已广泛应用于弓形虫病的检测诊断。

4 展望

目前，CLIA 方法在医学诊断、药物分析以及微生物检测等方面应用非常广泛，尤其是在人类医学的临床检测上，有取代放免分析技术和酶免分析技术成为医学检测主要手段的趋势，但在动物疫病检测方面的应用仍处于发展阶段。因此，要将CLIA 方法广泛应用于动物疫病检测和防控，必须加大对动物疫病CLIA 方法的研究，不断提高检测的灵敏度，拓宽检测范围，增强方法特异性、稳定性。为了更好地将该方法应用于市场，需要发展新型发光检测仪器，发展多通道、多组分检测和快速、自动化检测方法。

近年来，CLIA 技术与新传感器技术、微流控芯片技术等的联用，磁性微粒子（MPs）、金纳米粒子等新型材料在CLIA 中的应用以及新型反应增强剂和发光剂的出现，使得CLIA 的选择性、灵敏度、检测效率和检测通量都得到进一步提高，其正向着高特异性、高灵敏度、高通量、快速和自动化检测的方向发展。同时基于化学发光能量转移的均匀免疫分析[32]以及开发高通量、全自动及便携式检测仪器等也将成为CLIA 技术发展的方向。随着人们对人兽共患病以及食品安全等问题的重视，CLIA技术将会在动物疫病检测、诊断、微生物检测、药物残留分析及环境监测等领域发挥更大的作用。