间充质干细胞来源外泌体在恶性肿瘤中的作用及应用前景

黄磊，宋嘉琪，熊欣，孙廓，殷明

0 引言

恶性肿瘤是影响人类寿命的主要因素之一。随着放、化疗技术的出现，癌症患者的生存率在一定程度上得到了提高，然而其药物毒性及癌细胞对药物产生的耐药性也限制了药物的临床应用，因此，寻找新型抗癌药物成为了医学领域中的一大热点。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是能产生多种效能的原始细胞，能分化为多种不同细胞如脂肪细胞、软骨细胞及骨细胞等，其作为一种基于细胞的治疗方法已经受到了广泛关注。有研究表明以干细胞为基础的治疗方法可以与肿瘤细胞相互作用促进或抑制肿瘤细胞生长，因此间充质干细胞也被认为是肿瘤治疗的潜在靶点[1]。细胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）是一类由脂质双层膜组成的胞间通讯介质，通常分为外泌体、凋亡小体及微囊泡[2-3]。间充质干细胞能够分泌多种营养因子来调节组织的微环境，而在这一过程中间充质干细胞来源的外泌体（mesenchymal stem cell-derived exosomes,MSC-EXO）发挥着重要的功能，其能够对干细胞为靶点的疾病发挥显著作用，其中就包括对恶性肿瘤的影响。已有研究表明，人骨髓间充质干细胞来源外泌体能够通过激活Hedgehog信号通路促进肿瘤生长[4]，而Hedgehog通路与多种癌症密切相关，如肺癌、基底细胞癌、白血病等[5]，这也为MSC-EXO参与调控癌细胞进展提供了理论依据，在未来的治疗方案有望通过分子或基因调控MSC-EXO来调节肿瘤的进展，本文就MSC-EXO对恶性肿瘤的影响及其在临床上的应用前景作一综述。

1 间充质干细胞与外泌体

MSCs是一类具有自我更新、多向分化能力的多潜能祖细胞，可以从成熟的组织中获得，主要来源包括脐带、骨髓、脂肪、滑膜等[6]，由于其自我更新能力、多潜能和免疫调节特性，MSCs已成为医学领域中的一大热点，目前已有研究表明MSCs能够作为替换受损组织或病理损伤的主要细胞来源，同时MSCs不表达人类白细胞抗原HLA II分子，具有较低的免疫原性，因此可以抑制各种免疫效应细胞的功能，并能够促进调节免疫细胞的活性[1]。MSCs在肿瘤发生发展过程发挥至关重要的作用，一方面，MSCs提供了以肿瘤间质形成锚定肿瘤细胞的框架，分泌促进肿瘤生长的因子；另一方面，在细胞因子或趋化因子的影响下，存在于肿瘤微环境中的MSCs可以转化为M2型巨噬细胞或M2型微噬细胞[7]。MSCs在体内的作用机制很复杂，越来越多研究表明旁分泌机制是MSCs发挥功能的主要形式，而外泌体则是旁分泌的主要物质，由于其较低的毒性、免疫原性及不良反应，在未来有望将外泌体作为一种无细胞药物制剂应用于临床治疗中[8]。

2 外泌体的定义及间充质干细胞来源外泌体

澳大利亚学者Johnstone在1987年首次发现外泌体，Charles等于2001年首次在培养的绵羊红细胞上清液中检测到外泌体，2007年Valadi等发现外泌体中含有大量mRNA及microRNAs，并且在转移至受体细胞时这些mRNAs和microRNA具有改变细胞行为的能力，至此外泌体受到了学者们的广泛关注。外泌体是一类直径在30～100 nm之间的胞外囊泡，可在100 000g下离心收集，−80°C是储存外泌体的最佳温度[8]，外泌体包含多种蛋白质、核酸、脂质及胞质蛋白质如膜联蛋白、微管蛋白、肌动蛋白、热休克蛋白以及某些特定蛋白质如ESCRT相关蛋白（如TSG-101、Alix等）、Tab GTPase家族成员（如Rab7、Rab11B等）、四分子交联体如CD9、CD63、CD81等，这些也常常作为外泌体的表面标志物[9]，这些生物活性因子也广泛参与各类恶性肿瘤的生物学进程。外泌体能够作用于各类受体细胞，在免疫反应、肿瘤发展、组织再生及合成代谢等过程中起到重要作用，对外泌体加以修饰能够使其成为治疗恶性肿瘤的药物载体或作为肿瘤早期诊断的潜在生物标志物[10]。各类细胞、组织、体液均能分离得到外泌体，其中间充质干细胞来源的外泌体（MSC-EXO）因其免疫原性低，便于获取及储存等优点在近几年已经受到广泛的关注与研究，在基础医学与临床医学领域中已经成为一大新兴热点。

3 MSC-EXO在各类疾病中的作用

MSC-EXO包含多种RNA，其能够参与不同类型、不同位置的细胞通讯，并使受体细胞发生一系列生物学反应[11]，MSC-EXO蛋白及其各类RNA与多种生物特性及细胞进程相关，能够发挥如细胞间交流、免疫调节、组织修复与再生等功能，这种广布的生物活性使得MSC-EXO能与多种细胞相互作用。Li等研究发现，在类固醇诱导的股骨头坏死大鼠模型中来源于人脐带间充质干细胞的外泌体能够减缓大鼠股骨头坏死的进展，其机制可能与血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白-2（BMP-2）的升高有关[12]。Gong等研究发现，通过外泌体摄取miR-675能够下调骨肉瘤细胞中CALN1的表达，促进骨肉瘤细胞的增殖与转移[13]，并通过这项研究推断CALN1的上调也许能够抑制骨肉瘤细胞的发展。已有研究证实MSC-EXO还具有保护心肌细胞损伤[14]，维护肝[15]、肾功能[16]以及参与调节恶性肿瘤进展等[17]一系列作用，这些研究结果都为将MSC-EXO应用于临床治疗提供了依据。

4 MSC-EXO在恶性肿瘤中的作用

Stephen最初于1889年提出肿瘤微环境的概念，其表明癌细胞与宿主环境相互作用导致癌症进展，肿瘤微环境由细胞外基质、肿瘤细胞和肿瘤相关基质细胞如免疫细胞、内皮细胞等组成，外泌体是其中的主要通讯介质。研究表明，MSCEXO能够通过传递信号分子作为旁分泌介质发挥作用，其能够通过调控一系列细胞途径来调节恶性肿瘤的发生发展。已有研究证实，MSC-EXO可以通过支持或抑制两种方式影响肿瘤细胞的发生与发展[10]。Qi等研究已经证实骨髓间充质干细胞来源的外泌体（BMSCs-exo）在骨肉瘤和胃癌细胞系中能够通过激活Hedgehog信号通路促进骨肉瘤细胞与胃癌细胞生长[4]，其实验中发现当添加Hedgehog通路特异抑制剂GANT-61时，实验组中骨肉瘤细胞及胃癌细胞增殖能力明显降低，从而证实了BMSCs-exo能够通过激活Hedgehog这一信号通路促进癌细胞增长。在Yang等的实验中，对MSC-EXO的蛋白质分析发现，MMP-2与特异标志物CD90和胞外5’-核苷酸酶存在于其中，这些膜颗粒可被癌细胞迅速摄取，能够通过改变细胞功能和重组肿瘤微环境来促进乳腺癌、卵巢癌细胞增殖[18]。但也有研究表明miR-302A负载的HUMSCsexo能够通过抑制细胞周期蛋白D1的表达和AKT信号通路而抑制子宫内膜癌细胞的增殖与迁移[19]。Takahara等研究也表明脂肪间充质干细胞来源的外泌体（ADMSCs-exo）能够通过转运miRNA-145，降低Bcl-xl的活性促进肿瘤细胞凋亡抑制前列腺癌的生长[20]。这也表明MSC-EXO在肿瘤发生发展过程中起到了“双刃剑”的作用，即MSC-EXO对肿瘤细胞有着促进或抑制作用。不同组织来源的MSCEXO对癌细胞有着不同的影响，Wang等研究发现，肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）能够将MSCEXO转移至骨肉瘤细胞中，促进骨肉瘤细胞的迁移与侵袭，通过进一步体外研究发现，miR-1228在CAFs及其来源的外泌体中高度富集，能够通过下调骨肉瘤细胞中内源性SCAI mRNA与蛋白的水平达到促进骨肉瘤迁移的作用，而正常成纤维细胞却没有这项能力，对照组中骨肉瘤细胞的迁移能力也更低[17]。这也证明了不同组织来源的MSCEXO对恶性肿瘤细胞的发生发展有着各不相同的作用。

肿瘤的发生和转移过程与血管生成密切相关，MSC-EXO含有多种mRNAs及血管生成因子，与血管生成的过程密切相关。Ong等的研究发现，在兔急性心肌梗死模型中，MSC-EXO中的miRNA-126和miRNA-210能够激活存活激酶，促进新生血管形成，改善心功能[21]。Huang等的研究发现来源于骨髓间充质干细胞的外泌体（BMSCsexo）中富含多种miRNAs，能够作用于心肌细胞及血管中，进而发挥促进新生血管形成及抗血管重塑等作用[22]。Hu等的研究表明，来源于脂肪间充质干细胞的外泌体（ADMSCs-exo）可被成纤维细胞摄取，以剂量依赖的方式刺激细胞迁移、增殖与胶原合成，并增加cyclin-1、PCNA及ⅠⅢ型胶原基因表达，促进血管生成从而促使受损皮肤组织的修复[23]。这些研究结果均表明MSC-EXO在血管生成过程中发挥至关重要的作用，这也为MSC-EXO能够通过调节血管生成来影响肿瘤细胞发展提供了理论依据。随着恶性肿瘤的发展，肿瘤细胞能够释放基质降解蛋白酶降解细胞外基质，导致基底膜局部缺损，肿瘤细胞得以从缺损处通过发生局部浸润与转移，而MSC-EXO在肿瘤的转移过程中也发挥着重要作用。有研究发现在侵袭性头颈癌细胞中敲除与外泌体合成有关的Rab家族基因Rab271a后，癌细胞对细胞外基质的降解能力大幅减弱，表明外泌体对恶性肿瘤的侵袭性具有重要调节作用，其能够通过促进细胞外基质的降解从而促进肿瘤细胞的浸润与转移[24]。Zhang等研究发现骨髓间充质干细胞来源外泌体（BMSCs-exo）携带miR-193a-3p、miR-210-3p和miR-5100到受体细胞，激活STAT3信号通路诱导上皮间充质转化过程发生，增强肺癌细胞侵袭能力[25]。外泌体来源的miR-192还能通过减少破骨细胞生成因子来抑制恶性肿瘤诱导的骨溶解从而抑制癌症发生骨转移[26]。Wang等研究发现，MSC-EXO可以将miRNA-221转移至胃癌细胞，促进肿瘤细胞的生长及迁移[27]，这项研究也表明来源于癌细胞的MSC-EXO富含支持肿瘤细胞的miRNA-221，因此有利于恶性肿瘤的蔓延与转移，提示不同组织来源的MSC-EXO对肿瘤细胞的作用存在差异。Shimbo等[28]将miRNA-143转染后的MSC-EXO作用于骨肉瘤143B细胞后发现，骨肉瘤细胞的肺转移率明显降低。这些研究结果均表明在临床治疗中可以通过靶向调节MSC-EXO或其所含有的各类miRNAs来阻断癌细胞转移，为MSC-EXO治疗恶性肿瘤提供了理论依据。

5 MSC-EXO作为药物传递在癌症中的作用及其应用前景

提高药物的靶向性有利于提高药物的疗效并降低其毒副作用。MSC-EXO具备一定的靶向能力，对MSC-EXO进行合理修饰能使MSC-EXO有效的靶向进入肿瘤部位，发挥更强的抗癌作用。与传统的全细胞疗法相比，外泌体具有更大的优势，如药理毒性更低、免疫排斥反应等不良反应更少，且外泌体的获取及储存也更为便利[8]。许多研究对MSC-EXO中的miRNA测序分析发现，多种miRNA的表达与恶性肿瘤进展密切相关，如在乳腺癌发生淋巴转移时，miRNA-222表达水平上调，其能够直接靶向作用于肿瘤抑制因子PDLIM2，激活NF-kB信号通路促进乳腺癌细胞侵袭与转移[29]，这也表明MSC-EXO具有靶向进入肿瘤细胞的潜能。此外，还可以应用各种修饰方法将miRNA封装在MSC-EXO内。Kamerkar等研究发现在胰腺癌小鼠模型中，将携带癌基因Kras的特异siRNA或shRNA装载至MSC-EXO中（iExosomes）能够依赖CD47显著增强其疗效，提高了总体存活率[30]。Wang等研究表明miRNA-214转染后的MSC-EXO能够逆转胃癌细胞对顺铂的化疗耐药性，这也提示在未来MSC-EXO有望成为治疗顺铂耐药性胃癌的潜在药物[31]。其他也有研究发现转染后的MSC-EXO能够释放含有miRNA-379的外泌体抑制乳腺癌细胞生长，表明修饰后的MSCEXO能靶向传递至肿瘤部位并发挥治疗作用[32]。以上这些研究结果均证明了合理修饰MSC-EXO能够发挥更有效的抗癌作用，这也成为目前研究的热点，为将来MSC-EXO应用于临床提供了充足的依据。然而由于体内环境的复杂与多样性，还无法保证所修饰的MSC-EXO进入体内后是否具备预期的靶向性，因此对MSC-EXO的靶向修饰仍然是研究的重点与难点，此外对修饰后的MSC-EXO在体内的生物分布及免疫应答反应等问题也还需要进一步讨论。

6 展望

MSC-EXO由于其积极有效的治疗效果以及便于获取与操作等优点已经在科研领域受到广泛关注，MSC-EXO能够广泛参与肿瘤微环境中细胞之间的信息传递，对癌细胞的生长、迁移、侵袭与转移等过程均有重要影响。与基于MSCs的全细胞疗法相比，MSC-EXO具有免疫原性、毒性更低等优势。目前对于MSC-EXO的无细胞疗法还未得到广泛认可，应用于临床治疗中还需要进行深入研究，进一步阐述其发挥治疗效能的具体机制。MSC-EXO在医学领域虽得到了初步认识，但是其许多功能及具体作用机制还未完全阐明。适当修饰MSC-EXO使其作为药物传递的载体来调节癌细胞的发生发展已经得到了初步认识，随着对MSCEXO研究的深入，相信在未来临床中应用外泌体治疗恶性肿瘤能够取得更满意的效果，得到更广泛的应用。